Oznaczanie replikacji Legionella pneumophila w makrofagach poddanych działaniu pęcherzyków błony zewnętrznej

Streszczenie

Źródło: Jung, A. L. et al., Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Izolacja i analiza ich potencjału prozapalnego na makrofagach. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film przedstawia wstępne traktowanie makrofagów pęcherzykami błony zewnętrznej (OMV) Legionella pneumophila w celu zbadania ich wpływu na replikację bakterii. Zmieniając sygnalizację immunologiczną gospodarza, OMV sprawiają, że makrofagi są bardziej podatne na infekcje. Wyższa liczba kolonii w leczonych komórkach, w porównaniu z komórkami nieleczonymi, wskazuje, że OMV sprzyjają replikacji L. pneumophila wewnątrz makrofagów.

Protokół

1. Wstępne leczenie makrofagów

1. Przygotuj komórki THP-1 (komórki Tohoku Hospital Pediatrics-1, ludzka linia komórkowa białaczki monocytowej).
   UWAGA: THP-1 to monocytowa linia komórkowa pochodząca od pacjenta z białaczką.
   1. Dodaj 2x10⁵ komórek THP-1 na 24 dołki i różnicuj je, dodając 20 nM 12-mirystynianu 13-octanu (PMA) do komórek podobnych do makrofagów. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
   2. Zastąp pożywkę 500 μl świeżej pożywki i inkubuj przez kolejne 24 godziny; optymalna pożywka dla komórek THP-1 składa się z Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą.
2. Wyizoluj mysie makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (mBMDM).
3. Traktuj makrofagi pochodzące z THP-1 lub mBMDM za pomocą pęcherzyków błony zewnętrznej (OMV).
   1. Rozmrozić OMV i dodać je do ludzkich lub mysich makrofagów zgodnie z ich ilością białka (0,1, 1 i 10 μg/ml). Inkubować makrofagi z OMV w temperaturze 37 °C przez co najmniej 20 godzin.

2. Zainfekuj makrofagi i oceń replikację bakterii za pomocą testu jednostki tworzącej kolonię (CFU)

1. Użyj Legionella pneumophila, wstępnie potraktowanych komórek THP-1 lub mBMDM z kroku 4.3, a nie wstępnie potraktowanych makrofagów jako kontroli (2x10⁵/24 dołki). Nie wymieniaj nośnika.
2. Zakażone komórki THP-1 L. pneumophila Corby WT i mBMDM pozbawionym wiciowców mutantem L. pneumophila Corby (oba z wielokrotnością infekcji (MOI) 0,5; 1x10⁵ L. pneumophila/24 dołki) i inkubować odpowiednio przez 24 i 48 godzin.
3. Poddać komórki lizie w pożywce przez dodanie saponiny (końcowe stężenie: 0,1%) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
4. Zawiesić bakterie przez pipetowanie i przenieść zawiesinę do naczynia reakcyjnego. Przygotować seryjne rozcieńczenia pożywki zawierającej L. pneumophila w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
5. Smugi 50 μl wymaganych rozcieńczeń na płytkach agarowych z buforowanym ekstraktem drożdżowym z węgla drzewnego (BCYE) i inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C.
6. Wizualnie policz utworzone kolonie. Oblicz klasę CFU

<

img='image_resized' style='współczynnik proporcji:305/40;szerokość:75%;' src='https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/23949/Equation_1_editor_23949.jpg' alt='Equation_1.jpg' />

Znormalizuj wynik liczby CFU do makrofagów, które nie są wstępnie leczone, ale zainfekowane, które są ustawione na 100%.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10 cm petridish	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Niemcy)	82.1473
Węgiel aktywowany	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)	X865.2
Agar-agar, Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)	5210.2
Agar Columbia z 5 % krwią owczą	Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Niemcy)	254005
Azotan żelaza nonahydrat	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)	5632.1
Surowica cielęca płodu (FCS)	Life Technologies GmbH (Darmstadt, Niemcy)	10270-106
Inkubator dwutlenku węgla Heracell 240i	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Brunszwik, Niemcy)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Niemcy)	75004515
Pętla inokulacyjna	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Niemcy)	86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---	Uprzejmie dostarczone przez prof. dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Niemcy)
L. pneumophila Corby ΔflaA		------	Uprzejmie dostarczone przez prof. dr Klausa Heunera (RKI, Berlin, Niemcy)
mBMDM	---	---	Uprzejmie dostarczone przez prof. dr Markusa Schnare'a (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Niemcy) i prof. dr Carstena Kirschninga (University Duisburg Essen, Essen, Niemcy)
PBS	Biochrom GmbH (Berlin, Niemcy)	L 1825
Phorbol 12-mirystynian 13-octan	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Niemcy)	P8139-1MG
Wytrząsarka obrotowa (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Brunszwiku, Niemcy)	SHKE6000
RPMI 1640 high glucose	Life Technologies GmbH (Darmstadt, Niemcy)	11875-093
Saponin	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)	9622.1
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (Cambridge, Anglia)	80-2116-30
THP-1	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Niemcy)	88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Brunszwik, Niemcy)
Ekstrakt drożdżowy	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)	2363.2