Procedura zbierania bakterii i lizy mechanicznej

Streszczenie

Źródło: Mercier, N., et al. Oczyszczanie powinowactwa MS2 w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA u bakterii Gram-dodatnich. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film przedstawia krok po kroku procedurę zbierania komórek bakteryjnych i mechanicznej ich lizy w celu uwolnienia zawartości wewnątrzkomórkowej.

Protokół

1. Zbieranie bakterii

UWAGA: Ten etap obejmuje postępowanie z bakteriami chorobotwórczymi.

1. Wyhoduj jedną kolonię szczepów zawierających plazmidy pCN51-P3-MS2-sRNA lub pCN51-P3-MS2 w 3 ml pożywki Brain Heart Infusion (BHI) uzupełnionej erytromycyną (10 μg/μL) w duplikatach.
2. Rozcieńczyć każdą nocną hodowlę w 50 ml (≈1/100) świeżej pożywki BHI uzupełnionej erytromycyną (10 μg / μL), aby osiągnąć OD_{600 nm} 0,05. Użyj wysterylizowanych kolb o pojemności 250 ml (stosunek kolby do pożywki 5:1).
   UWAGA: Pożywkę i warunki wzrostu należy ustawić zgodnie ze wzorcem ekspresji badanego sRNA.
3. Hoduj kultury w temperaturze 37°C z wytrząsaniem z prędkością 180 obr./min przez 6 godzin.
4. Przenieś każdą kulturę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
5. Odwirować przy 2 900 x g przez 15 minut w temperaturze 4°C. Odrzucić supernatant.
6. Trzymaj granulki na lodzie i bezpośrednio przeprowadzaj mechaniczną lizę komórek lub zamrażaj i przechowuj granulki w temperaturze -80 °C.

2. Mechaniczna liza komórek

UWAGA: Następujące czynności należy wykonać na lodzie, a muszą mieć temperaturę 4 °C. Używać rękawiczek i podjąć wszelkie środki ostrożności w celu ochrony próbek przed RNazami.

1. Zawiesić granulki (krok 1.6) w 5 ml buforu A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ i 1 mM DTT).
2. Zawieszone komórki przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml z 3,5 g kulek krzemionkowych (0,1 mm).
3. Włóż probówki do mechanicznego przyrządu do lizy komórek. Uruchom cykl 40 s z prędkością 4,0 m/s.
   UWAGA: Jeśli jeden cykl nie wystarczy do rozbicia komórek, pozwól urządzeniu ostygnąć przez 5 minut, trzymając próbki na lodzie. Następnie powtórz kolejny cykl 40 s z prędkością 4,0 m/s. Skuteczność lizy komórek można przetestować, posiewając supernatant na płytce BHI-agar.
4. Wirować przy 15 700 x g przez 15 min. Odzyskać supernatant i utrzymać go na lodzie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
15 ml probówki wirówkowe	Falcon	352070
50 ml	Falcon	352051
250 ml kolba hodowlana	Dominique Dutscher	2515074	Kultury bakteryjne
BHI (napar z mózgu i serca) Rosół	Sigma-Aldrich	53286	Pożywka wzrostowa
Erytromycyna (ery)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Pożywka wzrostowa
Matryca lizująca B Bulk	MP Biomedicals	6540-428	Mechaniczna liza
RNAPro Roztwór	MP Biomedicals	6055050	Mechaniczna liza
Urządzenie FastPrep	MP Biomedicals	116004500	do lizy mechanicznej
Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	Kultury bakterii

Spektrofotometr