Izolacja małego regulatorowego docelowego RNA bakterii związanego z RNA za pomocą oczyszczania powinowactwa

Streszczenie

Źródło: Mercier, N., et. al., MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film pokazuje izolację znakowanego MS2 małego regulatorowego RNA (sRNA) związanego z bakteryjnym docelowym RNA przy użyciu oczyszczania powinowactwa fuzją białka wiążącego maltozę (MBP) i białka płaszcza MS2 unieruchomioną na żywicy amylozy.

Protokół

i pożywki

Do eksperymentów MAPS przygotuj następujące i pożywki:- Bufor A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ i 1 mM DTT)- Bufor E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltoza, 0,1% Triton, 1 mM MgCl₂ i 1 mM DTT)

Przygotowanie kolumny

UWAGA: Uważaj, aby nie dopuścić do wyschnięcia żywicy amylozy. W razie potrzeby uszczelnij kolumnę zaślepką. Przygotuj wszystkie roztwory przed rozpoczęciem oczyszczania powinowactwa.

1. Umieść kolumnę chromatograficzną w stojaku na kolumny.
2. Zdejmij końcówkę kolumny i umyj kolumnę ultraczystą wodą.
3. Dodać 300 μl żywicy amylozy.
4. Przemyć kolumnę 10 ml buforu A.
5. Rozcieńczyć 1,200 pmol białka MBP (białko wiążące maltozę)-MS2 w 6 ml buforu A i załadować go do kolumny.
6. Przemyć kolumnę 10 ml buforu A.

Oczyszczanie powinowactwa MS2 (Rysunek 1)

1. Załaduj lizat komórkowy do kolumny.
   UWAGA: Zachowaj 1 ml lizatu komórkowego (ekstrakt surowy, CE) w celu ekstrakcji całkowitego RNA i przeprowadzenia analizy Northern blot i transkryptomicznej.
2. Zebrać frakcję przepływową (FT) w czystej probówce zbiorczej.
3. Przemyć kolumnę 3 razy 10 ml buforu A. Zebrać frakcję płuczącą (W).
4. Eluować kolumnę za pomocą 1 ml buforu E i zebrać frakcję elucyjną (E) w mikroprobówce o pojemności 2 ml.
5. Wszystkie zebrane frakcje należy przechowywać na lodzie do czasu ekstrakcji RNA lub zamrozić w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.

Wyniki

Rysunek 1. Schematyczna ilustracja protokołu MAPS dostosowanego do Staphylococcus aureus. Od budowy plazmidu po analizę danych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,5 ml probówka do mikrowirówki	Sarstedt	72.690.001
15 mL probówki wirówkowe	Falcon	352070
Probówka do mikrowirówek 2 ml	Starstedt	72.691
250 ml kolba hodowlana	Dominique Dutscher	2515074	Kultury bakteryjne
50 ml probówki wirówkowe	Falcon	352051	Wirowanie kultur
Żywica amylowa	New England BioLabs	E8021S	Oczyszczanie powinowactwa MS2
pMBP-MS2	Addgene	65104	MS2-MBP
Kolumna chromatograficzna Poly-Prep	BioRad	7311550	Oczyszczanie powinowactwa MS2

Produkcja