$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie szczepów bakteryjnych lub bibliotek mutantów
1. Szczepy, które mają być testowane, należy rozmieścić na odpowiednich płytkach agarowych. Są to standardowe tabliczki do eksperymentu.
1. Inkubuj płytki przez noc w żądanej temperaturze, aby uzyskać pojedyncze kolonie. W tym eksperymencie posiewu posiewu K. pneumoniae (NTUH-K2044 i szczepy ATCC43816) na agarze z bulionu Luria (LB) w temperaturze 37 °C, a S. pneumoniae (23F typu dzikiego i 23F Δcps) na agarze z krwią w nawilżonym słoiku ze świecą w temperaturze 37 °C.
2. Wybierz pojedynczą kolonię z talerza bulionowego (krok 1.1), aby zaszczepić 10 ml odpowiedniego bulionu za pomocą sterylnej pętli lub patyczka koktajlowego. W celu przesiewu bibliotek losowych mutantów należy zaszczepić bulion 10 μl zapasu biblioteki losowych mutantów (biblioteka TraDIS).
1. Inkubować szczepy K. pneumoniae w pożywkach LB o niskiej zawartości soli w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, a szczepy S. pneumoniae w pożywkach do infuzji serca (BHI) statycznie w temperaturze 37 °C.
2. Przenieś kulturę z nocy do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj w wirówce stołowej przez 10 minut przy 3,200 x g w odchylanych wiadrach z wkładkami do probówek 15 ml i pokrywkami szczelnymi aerozolowo.
3. Odrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 2 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
UWAGA: Zutylizować supernatant w laboratorium za pomocą odpowiedniej drogi płynnych odpadów biologicznych. Celem etapów wirowania i ponownego zawieszania (ppkt 1.2.2 i 1.2.3) jest zagęszczenie bakterii w celu łatwej wizualizacji na nachyleniu. W razie potrzeby kultury bakteryjne można załadować bezpośrednio na gradient. Mocno kapsułkowane szczepy mogą nie tworzyć szczelnego osadu. Jeśli tak się stanie, należy usunąć jak najwięcej supernatantu bez usuwania jakichkolwiek komórek bakteryjnych, dodać 1x PBS do końcowej objętości 5 ml i ponownie zawiesić osad. Kontynuuj postępowanie z krokiem 1.2.5.
5. Odwirować probówki zgodnie z opisem w kroku 1.2.2.
6. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 2 ml 1x PBS. Ogniwa są teraz gotowe do użycia.
UWAGA: Gęstość zawiesiny komórek bakteryjnych nie jest krytyczna, ale musi być wystarczająca do wizualizacji w gradiencie. Sugerowana jest minimalna wartość OD600 (gęstość optyczna przy 600 nm) wynosząca 4.