Akustoforeza wspomagana aptamerem do mikroprzepływowej separacji bakterii Gram-ujemnych

Streszczenie

Źródło: Choi, H. J., et al. Akustoforeza mikroprzepływowa do przepływowego rozdzielania bakterii Gram-ujemnych za pomocą kulek powinowactwa aptamerowego. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film przedstawia metodę selektywnego oddzielania bakterii Gram-ujemnych od mieszanej próbki bakteryjnej za pomocą mikrogranulek pokrytych aptamerem i sił akustycznych w chipie mikroprzepływowym.

Protokół

1. Konfiguracja i obsługa akustoforezy
   1. Podłącz probówki z polieteroeteroketonu (PEEK) do dwóch wlotów do wstrzykiwania dwóch próbek i buforu oraz dwóch wylotów do zbierania i odprowadzania odpadów (Rysunek 1).
   2. Ręcznie napełnij kanał akustoforezy mikroprzepływowej demineralizowaną wodą bez pęcherzyków powietrza za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml.
   3. Przygotuj precyzyjny regulator ciśnienia z dwoma lub więcej kanałami wyjściowymi do sterowania przepływem płynu. Następnie napełnij fiolki odpowiednio do połowy próbką i buforem z dwoma otworami w ich nasadkach i podłącz je do wlotu chipa.
      UWAGA: Precyzyjny regulator ciśnienia z dwoma lub więcej kanałami wyjściowymi można zastąpić wieloma precyzyjnymi regulatorami ciśnienia. Na wlocie buforu przez regulator przepływu wtryskiwany jest bufor zdolny do generowania przepływu laminarnego, który zapobiega przemieszczaniu się próbki do środka podczas wstrzykiwania próbki.
   4. Po przygotowaniu urządzenia wstrzyknąć próbkę i bufor, przykładając ciśnienie 2 kPa do wlotu próbki i 4 kPa do wlotu buforu za pomocą precyzyjnego urządzenia sterującego ciśnieniem.
      UWAGA: W tym czasie, aby zapewnić płynny przepływ laminarny, ciśnienie wtrysku buforu powinno być wyższe niż ciśnienie wtrysku próbki. Przepływ jest kontrolowany przez regulator przepływu zamontowany na aspiratorze podłączonym do kanału doprowadzającego.
   5. Skoncentruj się na koraliku za pomocą przetwornika piezoelektrycznego (PZT), aby przesunąć go do środka kanału mikroprzepływowego podczas sprawdzania przez mikroskop.
      UWAGA: Im większy koralik, tym większy wpływ na przebieg, dzięki czemu łatwiej jest wyrównać go z punktem węzła. Generator funkcyjny ze wzmacniaczem dostarcza moc do PZT w celu wytworzenia fali sinusoidalnej w mikrokanale. Ponieważ górna i dolna część mikrokanału są wykonane ze szkła, generowana fala sinusoidalna jest odbijana i tworzy punkt węzłowy.
   6. Korzystając z jednokanałowego generatora funkcyjnego, wygeneruj częstotliwość rezonansową 3,66 MHz i wzmocnij typowy sygnał o 16 dB (około dziewięciokrotnie) za pomocą wzmacniacza mocy (ilustracja 1).
      UWAGA: Częstotliwość rezonansowa siłownika musi odpowiadać rozmiarowi kanału, ponieważ kanał jest kwadratowy, PZT działa z dokładną częstotliwością, aby utworzyć pojedynczy węzeł.
   7. Obserwuj procesy separacji i wzbogacania na chipie akustofluidycznym za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i szybkiej kamery działającej z prędkością 1 200 kl./s (klatek na sekundę).
   8. Określ ilościowo i przeanalizuj obecność lub brak bakterii Gram-ujemnych (GN) i bakterii Gram-dodatnich (GP), sprawdzając obrazy wykonane kamerą mikroskopu fluorescencyjnego kulek związanych z bakteriami i bakterii uwalnianych przez próbki pobierania i wylotu odpadów.
      UWAGA: Mikrogranulki z buforem, bakterie i aptamery przechodzą przez główny kanał, a mikrogranulki są wyrównywane centralnie za pomocą akustoforezy w chipie indukowanej przez PZT. Na koniec mikrogranulki, które związały bakterie GN, są zbierane w punkcie zbiórki, a niezebrane bakterie są odprowadzane przez wylot odpadów.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat systemu akustofluidycznego używanego do rozdzielania i zbierania komórek. Próbka lub roztwór buforowy jest wstrzykiwany do portu wlotowego przez regulator przepływu. W celu centrowania kulek i separacji próbek, prąd pr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10 μm Mikrokulki pokryte streptawidyną	Bang Laboratories	CP01007	Koraliki powinowactwa do aptamerów
Aptamer	Zintegrowane technologie DNA	GN3-6'RNA	do koniugacji bakterii
Escherichia coli DH5α	KCTC	KCTC2571	Bakterie docelowe
Generator funkcjonalny	GW Instek	AFG-2225	Generowanie częstotliwości
Szybka kamera	Photron	FASTCAM Mini	Obserwacja separacji
KOVAX-STRZYKAWKA 10 ml	Koreavaccine	22G-10ML	Napełnij kanał akustoforezy mikroprzepływowej wodą demineralizowaną bez pęcherzyków.
Mikroskop	Olympus Corp.	IX-81	Obserwacja separacji
rur PEEK	Saint-Gobain Ppl Corp.	AAD04103	Wstrzykiwanie lub zbieranie cząstek
Przetwornik piezoelektryczny	Fuji Ceramics	C-213	Generuj falę właściwą w kanale
Wzmacniacz mocy	Badania	wzmacniacza 75A250A	Zwiększ częstotliwość
Regulator ciśnienia/μflucon	AMED	AMED-μflucon	Sterowanie regulatorem ciśnienia/przepływu powietrza