Test in vivo w celu skorelowania bioluminescencji bakteryjnej z gęstością komórek

Streszczenie

Źródło: Brodl, E., et al. Pomiar in situ i korelacja gęstości komórek i emisji światła bakterii bioluminescencyjnych. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film pokazuje pomiar i korelację bioluminescencji z gęstością komórek w transformowanych bakteriach. Pojedyncza kolonia bakteryjna jest używana do zainicjowania płynnej kultury. Kulturę umieszcza się w studzience o pożądanym stężeniu komórek. Antybiotyk i induktor są dodawane w celu ekspresji genu wymaganego do bioluminescencji bakterii. Odczyty absorbancji i bioluminescencji są wykonywane w regularnych odstępach czasu za pomocą czytnika płytkowego.

Protokół

1. Projektowanie, przygotowanie i ekspresja luksa Operonu w Escherichia coli

Uwaga: Informacje na temat zestawów handlowych stosowanych w tej sekcji można znaleźć w Tabeli materiałów.

1. Do przeniesienia operonu luksowego do E. coli należy wybrać standardowy wektor pET z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi i interesującym genem oporności na antybiotyki (np. pET28a; NcoI, XhoI, kanamycyna).
2. Zaprojektuj fragmenty i nakładające się startery do montażu Gibsona w oparciu o sekwencję DNA Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).
3. Ustaw standardową reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z zaprojektowanymi starterami i wyizolowanym genomowym DNA (kwasem dezoksyrybonukleinowym) Photobacterium mandapamensis 27561 jako szablonu.
   UWAGA: Izolacja genomowego DNA odpowiedniego szczepu bakteryjnego zwiększa skuteczność PCR.
4. Oczyścić produkt PCR poprzez oczyszczanie za pomocą kolumny wirowej.
5. Przeprowadzić trawienie restrykcyjne izolowanego wektora pET28a za pomocą NcoI i XhoI w temperaturze 37 °C przez 45 minut.
6. Oczyść zlinearyzowany wektor i fragmenty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie oczyszczenia w kolumnie wirowej.
7. Określ stężenie DNA w każdym fragmencie i zlinearyzowanym wektorze i oblicz optymalne ilości do złożenia zgodnie z protokołem.
   UWAGA: Skuteczność montażu zależy od wielkości i liczby fragmentów i musi być dostosowana zgodnie z protokołem producenta.
8. Po połączeniu wszystkich fragmentów i buforu w probówce do PCR, inkubować mieszaninę montażową w maszynie do PCR w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę.
9. Przekształć zmontowany produkt wektorowy zgodnie ze standardowymi protokołami transformacji plazmidu bakteryjnego E. coli w odpowiedni system E. coli do wysokowydajnej replikacji plazmidu (np. E. coli TOP10 lub XL-1).
10. Wybierz kolonie z płytki transformacyjnej i umieść smugi na nowych płytkach w celu izolacji DNA.
11. Wyizoluj plazmidowe DNA zgodnie ze standardowymi protokołami.
12. Aby zweryfikować poprawność złożenia plazmidu, w tym wszystkich fragmentów, najpierw wykonaj PCR kolonii zgodnie ze standardowymi protokołami przy użyciu starterów specyficznych dla każdego zmontowanego fragmentu.
13. Oprócz PCR kolonii i późniejszej elektroforezy w żelu agarozowym, należy przygotować wszystkie izolowane wektory montażowe do sekwencjonowania DNA, aby zweryfikować prawidłowe złożenie i prawidłowe sekwencje DNA.
14. Przekształć zweryfikowany plazmid zgodnie ze standardowymi protokołami transformacji plazmidu bakteryjnego E. coli w odpowiedni system E. coli do wysokowydajnej produkcji białka (np. E. coli BL21).
    UWAGA: Kontynuuj bezpośrednio z poniższym protokołem ekspresji. W przypadku dłuższego przechowywania zaleca się przygotowanie bulionu glicerolowego.

2. Ekspresja zmodyfikowanych szczepów E. coli

1. Przygotować kulturę nocną (ONC) do ekspresji poprzez inokulację odpowiedniej objętości pożywki Luria-Bertani (LB) (np. 100 ml) wcześniej przygotowanym zapasem glicerolu komórek E. coli BL21 przekształconych za pomocą połączonego plazmidu lub bezpośrednio z płytki transformacyjnej. Dodać 100 μl kanamycyny (50 mg/ml; gen oporności na antybiotyki pET28a) i inkubować ONC w temperaturze 37 °C i 120 obr./min w wytrząsarce inkubatora przez noc.
2. Zaszczepić główną kulturę ekspresyjną (np. 800 ml pożywki LB) 8 ml ONC i dodać 800 μl kanamycyny (50 mg/ml).
3. Inkubować główną kulturę w temperaturze 37 °C i prędkości 120 obr./min w wytrząsarce inkubatora, aż gęstość komórek osiągnie OD₆₀₀ 0,6 - 0,8 (około 2,5 godziny).
4. Zmniejszyć temperaturę inkubacji do 28 °C.
5. Indukuj ekspresję białka poprzez dodanie propylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do końcowego stężenia 0,1 mM.
   UWAGA: Badania empiryczne wykazały, że obniżenie temperatury do 28 °C dało najwyższe natężenie światła.
6. Obserwuj komórki, aż zaczną świecić (około 1 godziny).
   UWAGA: W zależności od celu ekspresji, komórki są hodowane do następnego dnia, a następnie zbierane lub komórki mogą być utrzymywane w drżeniu tak długo, jak długo świecą (maksymalnie 48 godzin). Pobieranie komórek i oczyszczanie wszelkich białek można przeprowadzić zgodnie ze standardowymi procedurami.

3. Ekspresja bakteryjnych szczepów bioluminescencyjnych

UWAGA: Bakteryjne szczepy bioluminescencyjne wymagają specjalnego podłoża wzrostowego / sztucznego podłoża wody morskiej do wzrostu i produkcji światła.

1. Przygotować sztuczną pożywkę z wody morskiej składającą się z dwóch oddzielnie przygotowanych składników pożywki.
   UWAGA: Poniższe ilości dotyczą 1 l pożywki płynnej lub 1 l podłoża agarowego.
   1. Dla sztucznej pożywki z wodą morską należy wprowadzić następujące sole: 28,13 g NaCl (chlorek sodu), 0,77 g KCl (chlorek potasu), 1,60 g CaCl₂ · 2H₂O (dwuwodny chlorek wapnia), 4,80 g MgCl₂ · 6H₂O (sześciowodny chlorek magnezu), 0,11 g NaHCO₃ (wodorowęglan sodu) i 3,50 g_MgSO4 · 7H₂O (siedmiowodny siarczan magnezu).
   2. Dodać 1 l wody destylowanej i rozpuścić wszystkie składniki.
   3. W przypadku podłoża LB należy zważyć następujące składniki: 10 g ekstraktu drożdżowego, 10 g peptonu, a w przypadku płytek agarowych dodatkowe 20 g agaru.
   4. Dodaj 250 ml wody z kranu i rozpuść składniki.
   5. Oba przygotowane podłoża należy sterylizować w autoklawie oddzielnie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.
   6. W przypadku płytek agarowych należy połączyć 250 ml pożywki LB z 750 ml pożywki ze sztucznej wody morskiej bezpośrednio po autoklawowaniu i przygotować płytki.
   7. W przypadku pożywki płynnej należy połączyć 250 ml pożywki LB z 750 ml pożywki ze sztucznej wody morskiej bezpośrednio po autoklawowaniu lub po schłodzeniu.
      UWAGA: Sztuczne podłoże z wodą morską może stać się mętne w wyniku wytrącania się soli.
2. Szczepy bakterii bioluminescencyjnych należy rozprowadzić na płytkach agarowych ze sztucznej wody morskiej i inkubować przez noc w temperaturze 24 - 30 °C.
   UWAGA: Długie przechowywanie szczepów bakteryjnych odbywa się zwykle poprzez zamrażanie zapasów glicerolu w kulturze bakteryjnej. Szczepy powinny być zawsze najpierw rozrzucone na płytkach agarowych, aby zapewnić jednolite warunki początkowe dla wszystkich szczepów, przed użyciem do kultur płynnych, ze względu na opóźnioną fazę wzrostu po rozmrożeniu.
3. Przygotować ONC, zaszczepiając 100 ml sztucznej pożywki z wodą morską pojedynczą kolonią z płytki. Inkubować ONC w temperaturze 24 - 30 °C i 120 obr./min w wytrząsarce inkubatora przez noc.
4. Zaszczepić 800 ml sztucznej pożywki z wodą morską za pomocą 8 ml ONC.
5. Inkubować komórki bakteryjne w temperaturze 24 - 30 °C i prędkości 120 obr./min w wytrząsarce inkubatora.
   UWAGA: Profil natężenia światła bakterii bioluminescencyjnych silnie zmienia się w zależności od temperatury. W zależności od mechanizmów regulacyjnych produkcji światła przez dany szczep bakterii, emisja światła może rozpocząć się po około 1 - 6 godzinach.
6. Obserwuj hodowle komórek bakteryjnych, aż zaczną świecić (około 1 - 6 godzin).
   UWAGA: W zależności od celu ekspresji, komórki są hodowane do następnego dnia, a następnie zbierane lub komórki mogą być utrzymywane w drżeniu tak długo, jak długo świecą. Pobieranie komórek i oczyszczanie wszelkich białek można przeprowadzić zgodnie ze standardowymi procedurami.

4. Test aktywności in vivo dla bioluminescencyjnych szczepów bakteryjnych i zmodyfikowanych szczepów E. coli

UWAGA: Długie przechowywanie szczepów jest zwykle osiągane poprzez zamrażanie zapasów glicerolu w kulturze bakteryjnej. Szczepy powinny być zawsze najpierw rozrzucone na płytkach agarowych, aby zapewnić jednolite warunki początkowe dla wszystkich szczepów, przed użyciem do kultur płynnych, ze względu na opóźnioną fazę wzrostu po rozmrożeniu.

1. Umieść pożądany bioluminescencyjny szczep bakterii lub zmodyfikowany szczep E. coli na płytce agarowej i inkubuj w temperaturze 28 °C przez noc.
   UWAGA: Temperatura inkubacji może się różnić w zależności od szczepu i musi być oceniona empirycznie. Aby móc porównać bioluminescencyjne szczepy bakterii i zmodyfikowane szczepy E. coli, warunki wzrostu muszą być identyczne.
2. Zaszczepić 3 ml pożywki odpowiednim szczepem pojedynczą kolonią z płytki agarowej i inkubować komórki w temperaturze 28 °C i 180 obr./min w wytrząsarce inkubatora przez około 1-2 godziny.
3. Zmierzyć gęstość komórek w rozcieńczeniu płynnej kultury w stosunku 1:10 przy długości fali 650 nm. Obliczyć stosunek i objętość dla 1 ml kultury z OD650 0,05,
   UWAGA: Kolejny test czytnika płytek określi gęstość komórek przy 650 nm, aby uniknąć zakłóceń spowodowanych emisją światła przez szczepy.
4. Odpipetować obliczoną objętość kultury i pożywki do 24-dołkowej płytki o czarnych ściankach ze szklanym dnem. W przypadku zmodyfikowanego szczepu E. coli do próbek dodać 1 μl kanamycyny (antybiotykooporność wektora pET28a) i 1 μl IPTG (indukcja ekspresji genu). Umieścić pokrywkę na płytce, aby uniknąć parowania podczas pomiarów.
   UWAGA: W celu zapewnienia, że wektor pET28a zawierający cały operon luksów nie zostanie utracony przez kulturę E. coli, kanamycyna musi być dodana do każdej próbki E. coli w studzienkach płytkowych oraz w celu zapewnienia, że można zmierzyć lekką produkcję komórek E. coli, ekspresja genu musi być indukowana przez IPTG. Aby uniknąć przesłuchów i zakłóceń pomiarowych, najlepsze wyniki wykazały płytki studzienne o czarnych ściankach ze szklanym dnem i przezroczystymi pokrywkami. Niemniej jednak można zaobserwować przesłuchy, a pozycje studni muszą być starannie wybierane.
5. Rozpocznij pomiar w czytniku płytek.
   UWAGA: Protokół czytnika płytek jest oparty na skrypcie opracowanym specjalnie dla tego testu, który łączy dwa pomiary, absorbancję i bioluminescencję. Punkty danych są zbierane co 10 minut z ciągłym wstrząsaniem między pomiarami i stałą temperaturą 28 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Zestaw do klonowania	New England Biolabs Inc.	E2621S	dla 10 rxndx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad
polimerazy Phusion	Thermo Scientific	F530S
Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności	New England Biolabs Inc.	M0491S
GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit	Thermo Scientific	K0721	do 50 enzymów
restrykcyjnych i buforu rxn (NcoI, XhoI)	New England Biolabs Inc.	R3193S/R0146S
Wizard SV Żel i zestaw do czyszczenia PCR	Promega	A9282	do 250 rxn
Zestaw do ekstrakcji żelu DNA Monarch	New England Biolabs Inc.	#T1020S	dla 50 rxn
GeneJet Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0503	dla 250 rxn
GoTaq G2 DNA Polimeraza	Promega	M7841
24-dołkowa płytka sensologiczna ze szklanym dnem	Greiner Bio One	662892
Czytnik płytek FLUOStar Omega	BMG Labtech
OPTIMA/Mars Analysis Oprogramowanie	BMG Labtech		Wersja 2.20
Microsoft Excel 2010
Multitron Standard Incubator Shaker	Infors AG

Microsoft