Hodowla bakterii Magnetospirillum i ocena ich zachowania magnetotaktycznego

Streszczenie

Źródło: Le Nagard, L., et al. Hodowla bakterii magnetotaktycznych z rodzaju Magnetospirillum: szczepy MSR-1, AMB-1 i MS-1. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film pokazuje, jak hodować bakterie Magnetospirillum w warunkach mikrotlenowych przy użyciu pożywek zarówno płynnych, jak i półstałych. Podkreśla tworzenie się widocznego pasma bakteryjnego na granicy faz tlenowo-beztlenowych i jego migrację w górę wraz z wyczerpaniem tlenu. Film pokazuje również, jak ocenić zachowanie magnetotaktyczne poprzez obserwację kierunkowego pływania w odpowiedzi na pole magnetyczne.

Protokół

1. Inokulacja bakterii magnetotaktycznych (MTB)

UWAGA: Kultury szczepów AMB-1, MS-1 i MSR-1 można uzyskać komercyjnie (tabela materiałów).

UWAGA: Wszystkie poniższe czynności należy wykonać w sterylnych warunkach, pod płomieniem palnika Bunsena.

1. Inokulacja szczepów MSR-1, AMB-1 i MS-1 w płynnym podłożu
   1. Zamknij pustą butelkę po 125 ml surowicy korkiem z kauczuku butylowego i aluminiową uszczelką zaciskaną. Wprowadzić dwie igły do butelki przez korek i podłączyć strzykawkę do jednej z nich. Podłączyć strzykawkę do butli o średnicy_O2 za pomocą tego samego typu rurki, co rurka używana w stacji_N2.
   2. Pozwól_O2 przepływać przez butelkę przez około 30 minut, aby upewnić się, że całe powietrze w butelce zostało zastąpione przez_O2. Usuń obie igły, dopuszczając do lekkiego nadciśnienia w butelce, a następnie autoklawu. Przed użyciem pozwól butelce ostygnąć do temperatury pokojowej.
      UWAGA: Aby zaoszczędzić czas, wykonaj kroki 1.1.1 i 1.1.2 podczas przygotowywania pożywki i autoklawuj butelkę wraz z pożywką lub roztworami podstawowymi.
   3. Wysterylizuj górne części korków zarówno butelki ze świeżą pożywką, jak i butelki_O2, nakładając na nie kilka kropelek 70% roztworu etanolu i przepuszczając je przez płomień palnika Bunsena.
   4. Za pomocą sterylnej strzykawki i igły pobrać 1 ml_O2 z butelki_O2 i przenieść do butelki ze świeżą pożywką. Na tym etapie należy upewnić się, że igła ściśle przylega do strzykawki, aby uniknąć przedostania się powietrza do strzykawki.
   5. W przypadku użycia inokulum z innej kultury wyhodowanej w szklanej butelce, wysterylizuj korki zarówno butelki ze świeżą pożywką, jak i starszej butelki hodowlanej, nakładając na nie kilka kropelek 70% roztworu etanolu i przepuszczając je przez płomień palnika Bunsena. Jeśli używasz inokulum z probówki z zamrożoną kulturą, po prostu pozwól mu rozgrzać się do temperatury pokojowej z probówką zamkniętą pod płomieniem palnika Bunsena.
   6. W przypadku stosowania inokulum z innej kultury wyhodowanej w szklanej butelce, należy zaszczepić 1 ml starszej kultury w świeżej pożywce. W przypadku stosowania inokulatu z zamrożonego wywaru, należy zaszczepić tylko 0,1 ml w celu rozcieńczenia glicerolu lub dimetylosulfotlenku (DMSO) stosowanego w procesie zamrażania. W obu przypadkach należy użyć sterylnej igły i sterylnej strzykawki.
   7. Inkubować kulturę w temperaturze 32 °C i po 4-7 dniach zaszczepić ją w świeżej pożywce.
2. Inokulacja MSR-1 w półstałym podłożu o gradiencie O₂
   1. Sprawdź, czy probówka ze świeżą pożywką wykazuje dobrze zdefiniowany interfejs tlenowo-beztlenowy (OAI), zmaterializowany przez interfejs od różowego do bezbarwnego.
   2. Jeśli inokulum pochodzi z innej półstałej kultury o gradiencie stężeń_O2, należy zebrać bakterie, pipetując 50 μl kultury za pomocą sterylnej końcówki pipety umieszczonej na opasce utworzonej przez bakterie. Powoli zaszczepiaj te bakterie w OAI w świeżej pożywce (różowy/bezbarwny interfejs), unikając zakłócania interfejsu. Jeśli inokulum pochodzi z zamrożonej hodowli, należy postępować w ten sam sposób ze 100 μl inokulum.
   3. Zamknąć probówkę i pozwolić bakteriom rozwijać się w temperaturze od 25 °C do 30 °C. Przenieść do świeżej pożywki, stosując tę samą procedurę, zanim pasmo bakterii dotrze do powierzchni pożywki.

2. Obserwacja bakterii

1. Wysterylizuj korek butelki hodowlanej, nakładając na nią 70% roztwór etanolu i przepuszczając go przez płomień palnika Bunsena. W przypadku podłoża półstałego otwórz rurkę pod płomieniem palnika Bunsena. Użyj sterylnej igły i sterylnej strzykawki, aby usunąć bakterie.
2. Użyj metody wiszącej kropli8, aby upewnić się, że bakterie są zarówno magnetyczne, jak i ruchliwe.
   UWAGA: Mikroskopia z kontrastem fazowym daje doskonałe wyniki, ale nie jest obowiązkowa. Odpowiednie są powiększenia od 10X do 60X.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AMB-1	Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)	ATCC 700264
MS-1	ATCC	ATCC 31632
MSR-1	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)	DSM 6361
L-cysteina.HCl.H₂O	Sigma-Aldrich	C7880-100G
Strzykawki 1,0 ml	Fischer scientific	B309659
25G x 1 igiełki	BD	305125
20 mm aluminiowe uszczelki	Wheaton	224223-01
20mm E-Z	Zaciskarka Wheaton	W225303
Korki z kauczuku butylowego	Bellco Glass, Inc.	2048-11800
Rurki Hungate	Chemglass (VWR)	CLS-4208-01
Korek przegrody, 13mm, Hungate	Bellco Glass, Inc.	2047-11600
Rurki do hodowli szkła	Corning (VWR)	9826-16X

125 ml butelki z serum Wheaton 223748