$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotować rozcieńczenia panelu MIC
- Przygotować roztwór podstawowy nie wyższy niż 1 600 μg/ml dalbawancyny w czystym (czystym) dimetylosulfotlenku (DMSO) w sterylnych szklanych lub plastikowych probówkach i użyć tego samego dnia przygotowania lub przechowywać w temperaturze od -20 do -60 °C lub niższej do wykorzystania w przyszłości w zamrażarce bez rozmrażania. Podczas ważenia proszku należy wziąć pod uwagę siłę działania dalbawancyny zawartą w dokumentacji dołączonej do proszku.
- Rozcieńczyć rozcieńczenie wyjściowe podobnie jak w schemacie za pomocą schludnego DMSO w sterylnych szklanych lub plastikowych probówkach. Użyć jednej pipety do odmierzenia rozcieńczalnika, a drugiej pipety do dodania początkowego bulionu dalbavanciny do pierwszej probówki. Do każdego kolejnego stężenia wyjściowego dalbavancyny należy użyć nowej pipety.
- Przygotuj 100-krotne końcowe rozcieńczenia stężenia panelu MIC (stężenia pośrednie) za pomocą schludnego DMSO. Połącz odpowiednie objętości źródła i DMSO, aby uzyskać pożądane stężenie pośrednie (objętości, które należy zastosować, będą zależeć od liczby paneli MIC, które mają zostać wykonane).
- Przygotować 0,004% P80: Przygotować świeży roboczy roztwór podstawowy 2% P80, dodając 0,1 ml P80 do 4,9 ml dH₂O. Sterylizować, przepuszczając przez filtr 0,22 μm i użyć roztworu w tym samym dniu przygotowania. Przygotować rozcieńczalnik P80 w proporcji 0,004%, rozcieńczając 2% P80 w stosunku 1:500 (np. 0,3 ml 2% P80 do 149,7 ml CAMHB).
- Ponadto rozcieńczyć stężenia pośrednie w stosunku 1:100 w bulionie Muellera Hintona (CAMHB) skorygowanym kationami uzupełnionym 0,004% (v/v) polisorbatu-80 (P-80) i / lub LHB (dla paciorkowców) dodanym w stężeniu dwukrotnie wyższym niż końcowe stężenie, ponieważ dodanie inokulum spowoduje rozcieńczenie 1:2.
2. Przygotuj panele MIC
- Dozować 50 μl każdego przygotowanego roztworu dalbawancyny do odpowiednich dołków panelu MIC i umieścić pożywkę tylko w jednym dołku (studzienka kontrolująca wzrost). Do tego etapu można użyć pipety wielokanałowej ze sterylnymi końcówkami.
- Panele należy natychmiast zużyć lub uszczelnić folią z tworzywa sztucznego, umieścić je w plastikowych torebkach i natychmiast umieścić w zamrażarce bez rozmrażania w temperaturze ≤ -20 °C (najlepiej ≤ -60 °C) do momentu, gdy będą potrzebne. Jeśli używane są zamrożone panele, usuń uszczelki i umieść pojedyncze panele na stole laboratoryjnym na 15-30 minut (do momentu rozmrożenia zawartości studzienki) przed przystąpieniem do inokulacji panelu.
3. Zaszczep panele MIC, wykonaj czystość i skonfiguruj liczbę kolonii
- Wybierz kilka dobrze wyizolowanych kolonii z 18-24-godzinnego agaru z krwią lub innej nieselektywnej płytki agarowej. Dotknij górnej części każdej kolonii sterylną pętlą lub wacikiem i przenieś do 1-5 ml CAMHB lub soli fizjologicznej, aż zmętnienie będzie równoważne 0,5 wzorca McFarlanda. Oceń zmętnienie przez wizualne porównanie z 0,5 McFarlanda lub za pomocą urządzenia fotometrycznego.
- W ciągu 15–30 minut od przygotowania rozcieńczyć inokulum w stosunku 1:100 w CAMHB (100 μL w 10 ml CAMHB). W przypadku większości bakterii badanych pod kątem dalbawancyny, z wyjątkiem S. pneumoniae, to rozcieńczenie zapewni końcowe stężenie studzienki 5 × 10⁵ CFU/ml (dopuszczalny zakres to 2–8 × 10⁵ CFU/ml). W przypadku S. pneumoniae stężenie bakterii oparte na porównaniu zmętnienia do 0,5 McFarlanda jest zwykle znacznie niższe. Dlatego rozcieńczyć inokulum w stosunku 1:25 (400 μL w 10 ml CAMHB + 10% LHB).
- W ciągu 15 minut po przygotowaniu inokulum przenieść 50 μl końcowego inokulum do każdej studzienki (z wyjątkiem studzienki kontrolnej sterylności) przygotowanego panelu MIC. Do tego etapu można użyć pipety wielokanałowej ze sterylnymi końcówkami.
- Przeprowadzić kontrolę czystości, przenosząc i rozprowadzając 1–10 μl podwielokrotności z dołka dodatniej kontroli wzrostu za pomocą sterylnej pętli do nieselektywnego agaru (np. agaru sojowego z tryptykazą z 5% krwią owczą).
- Ustaw liczbę kolonii, usuwając 10 μl z dołka kontrolnego wzrostu za pomocą jednokanałowej pipety i sterylnej końcówki, a następnie przenosząc do 10 ml soli fizjologicznej (rozcieńczenie 1:1,000). Wymieszać i przenieść 100 μl za pomocą jednokanałowej pipety i sterylnej końcówki do odpowiedniego nieselektywnego podłoża agarowego (np. agaru sojowego z tryptykazą z 5% krwią owczą) i rozprowadzić na całej powierzchni agaru za pomocą sterylnej pętli, powtarzając dwa razy w różnych kierunkach, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie inokulum (rozcieńczenie 1:10).
4. Inkubuj panele MIC, liczbę kolonii i płytki czystości
- Przed inkubacją zapieczętuj każdy panel MIC lub stos nie więcej niż czterech paneli w plastikowej torbie z plastikową taśmą lub ciasno przylegającą plastikową osłoną. Alternatywnie, umieść pusty panel MIC na górze stosu nie więcej niż 4 paneli MIC, umieść wilgotny ręcznik papierowy w plastikowym pojemniku, umieść panele MIC w plastikowym pojemniku i szczelnie zamknij pojemnik pokrywką. Panele MIC inkubować w inkubatorze z otaczającym powietrzem w temperaturze 35 °C ± 2 °C przez 16–20 godzin (gronkowce i enterokoki) i 20–24 godziny (paciorkowce) w ciągu 30 minut od inokulacji. Inkubować płytki zliczające i czystości kolonii w tych samych warunkach, z wyjątkiem inkubacji paciorkowców w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂.
5. Przeczytaj tabliczki MIC i Colony Count; Sprawdź tabliczkę czystości
- Odczytaj MIC jako najniższe stężenie, które całkowicie hamuje rozwój bakterii w studzienkach, wykryte gołym okiem.
- Policz kolonie na tabliczce do liczenia kolonii. Pomnóż każdą kolonię przez współczynnik rozcieńczenia (1:10 000) (np. 50 kolonii odpowiada 5 × 10⁵ CFU/ml). Dopuszczalny zakres to 20–80 kolonii (2–8 × 10⁵ CFU/ml) i jest stosowany jako przybliżona wytyczna.
- Sprawdź tabliczkę czystości. Jeśli wszystkie kolonie są podobne do każdej kolonii, inokulum można uznać za czyste. Jeśli obecne są jakiekolwiek inne kolonie, istnieje możliwość obecności zanieczyszczenia w panelu MIC i test należy powtórzyć.