Wizualizacja endo-lizosomalnej przebudowy za pośrednictwem nanocząstek w komórkach zakażonych bakteriami

Streszczenie

Źródło: Zhang, Y., et al. Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film pokazuje zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do wizualizacji endolizosomalnej przebudowy w ludzkich komórkach nabłonka zakażonych przez bakterie wewnątrzkomórkowe. Po inwazji bakteryjnej patogeny manipulują cytoszkieletem gospodarza i układem endolizosomalnym, tworząc wakuole z wypustkami rurkowymi, które zmieniają transport pęcherzyków. Znakowane fluorescencyjnie nanocząstki są następnie wykorzystywane do śledzenia tych zmian, co pozwala na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości zdarzeń transportu wewnątrzkomórkowego wywołanych przez patogeny.

Protokół

1. Hodowla komórek HeLa
   1. Komórki HeLa trwale eksprymujące LAMP1-GFP (Lizosom-associated membrane glycoprotein 1-Green fluorescencyjne białko) są hodowane w Dulbecco's Modified Eagle Medium lub DMEM z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) i hodowane w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO₂ .
   2. Wysiewaj komórki o gęstości 50 000 na studzienkę w 8-dołkowym szkiełku podstawowym (Ibidi) i inkubuj przez noc (O/N).
2. Kultura bakterii
   1. Użyj szczepu Salmonella enterica serowar Typhimurium NCTC 12023 typu dzikiego (WT). Dla porównania, należy użyć zmutowanych szczepów ΔssaV wadliwych w SPI2-T3SS i ΔsifA bez kluczowego efektora SifA dla SIF. Szczepy zawierające plazmid pFPV25.1 należy stosować do konstytutywnej ekspresji wzmocnionego GFP.
      UWAGA: Szczepy bakteryjne są rutynowo hodowane w bulionie Luria-Bertani (LB) z dodatkiem 50 μg/ml karbenicyliny (WT) i LB z dodatkiem 50 μg/ml karbenicyliny i/lub 50 μg/ml kanamycyny (ΔssaV, ΔsifA) wymaganych do utrzymania plazmidów.
   2. Zaszczepić pojedynczą kolonię bakterii w 3 ml LB odpowiednimi antybiotykami i hodować O/N w temperaturze 37 ºC w warunkach wstrząsania w celu napowietrzenia, a następnie rozcieńczyć w stosunku 1:31 w świeżym LB i kontynuować wzrost przez 3,5 godziny. W tym momencie kultury osiągają późną fazę logarytmiczną, a bakterie są wysoce inwazyjne. "Bęben rolkowy" jest wygodny do inkubacji kultur w probówkach z napowietrzaniem.
3. Zakażenie komórek HeLa przez nanocząstki Salmonelli i Gold-BSA-Rhodamine lub NP Znakowanie impulsowe NP (patrz rysunek 1 dla schematu)
   1. Zmierz OD₆₀₀ subkulturowanych bakterii i rozcieńcz do OD₆₀₀ = 0,2 w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS (~3 × 10⁸ jtk/ml), dodać odpowiednie ilości bakterii do komórek HeLa w 8-dołkowych szkiełkach komorowych, aby osiągnąć wielokrotność infekcji (MOI) wynoszącą 100.
   2. Inkubować przez 30 minut w inkubatorze komórkowym, przemyć 3 razy PBS w celu usunięcia niezinternalizowanych bakterii (ten punkt czasowy ustalono jako 0 godzin po zakażeniu lub 0 godzin p.i.). Dodać 300 μl świeżej pożywki zawierającej 100 μg/ml gentamycyny i przechowywać przez 1 godzinę. Następnie zastąpić pożywkę świeżą pożywką zawierającą 10 μg/ml gentamycyny na pozostałą część czasu inkubacji.
   3. Po inkubacji z pożywką zawierającą 100 μg/ml gentamycyny przez 1 godzinę, pożywkę zastępuje się pożywką do obrazowania (MEM Eagle'a bez FCS, L-glutaminy, czerwieni fenolowej i wodorowęglanu sodu, z 30 mM HEPES, pH 7,4) zawierającą 10 μg/ml gentamycyny. Nanocząsteczki złoto-BSA-rodaminy dodaje się do komórek HeLa w celu uzyskania końcowego stężenia OD₅₂₀ = 0,1. (Albumina surowicy bydlęcej lub BSA)
      UWAGA: NPs Gold-BSA-rhodamine mogą być również dodawane do komórek przed zakażeniem lub w różnych punktach czasowych p.i.
   4. Po 1 godzinie inkubacji usunąć pożywkę, przemyć 3 razy PBS i dodać 300 μl świeżej pożywki obrazowej zawierającej 10% FCS i 10 μg/ml gentamycyny na pozostałą część czasu inkubacji.
      UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od stężenia NP i użytych linii komórkowych. W przypadku makrofagów RAW264.7 zaobserwowaliśmy, że 30-minutowa inkubacja z NP o stężeniu OD₅₂₀ = 0,05 pozwoliła na wystarczającą internalizację.

Wyniki

Rysunek 1. Schemat przygotowania komórek HeLa do obrazowania żywych komórek. Komórki HeLa wysiewano w szkiełkach komorowych, pozorowano lub zakażono różnymi szczepami Salmonelli przez 30 minut, przemywano 3 razy PBS, a następnie inkubo...

Materiały