Hodowla prątków gruźlicy w warunkach ograniczonych żelazem

Streszczenie

Źródło: Gupta, S., et al. Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film pokazuje procedurę hodowli Mycobacterium tuberculosis w warunkach ograniczonych żelazem w celu wywołania stresu żelazowego i promowania wydzielania sideroforów, które wspierają przeżycie bakterii.

Protokół

1. Uprawa prątków w warunkach ograniczonych żelazem

1. Rozmrozić 50 μl zamrożonego 15% glicerolu Mtb (Mycobacterium tuberculosis) i ułożyć na płytce agarowej uzupełnionej 10% wzbogaceniem ADN (albumina – dekstroza – NaCl) (5 g/l albuminy, 2 g/l dekstrozy i 0,85 g/l chlorku sodu, 0,2% glicerolu i 0,05% Tween-80). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C aż do momentu, gdy pojawią się kolonie.
2. Zaszczepić pojedynczą kolonię Mtb w 2 ml bulionu prątkowanego (tabela materiałów) uzupełnionej wzbogaceniem ADN. Inkubować z mieszaniem w temperaturze 37 °C.
3. Niech kultura Mtb urośnie do późnej fazy logarytmicznej (OD₅₄₀ wynosi ~0,8). Aby to sprawdzić, zmierz OD₅₄₀ za pomocą spektrofotometru.
4. Rozprowadzić 200 μl późnej kultury logarytmicznej na płytkach agarowych prątków (tabela materiałów) uzupełnionych 0,2% glicerolu, 0,05% Tween-80 i ADN. Zaszczepić co najmniej 5 płytek. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C do momentu, gdy rozwój bakterii będzie widoczny w postaci zlewającej się warstwy. Zajmuje to ~1 tydzień dla Mtb.
5. Zwilż sterylny bawełniany wacik w LIMM (minimalny nośnik o niskiej zawartości żelaza). Użyj tego wacika, aby zebrać bakterie z płytek agarowych i zaszczepić 100 ml LIMM, aby przygotować skoncentrowaną zawiesinę bakteryjną o OD₅₄₀ ~1,0.
6. Rozcieńczyć tę zawiesinę 10 razy do objętości 1 l za pomocą LIMM i podzielić ją na dwie sterylne butelki z tworzywa sztucznego o pojemności 2 litrów, z których każda zawiera 500 ml kultury.
7. Wyjmij 2 ml kultury i przenieś ją do probówki hodowlanej o pojemności 5 ml. Dodać 10 μl tyloksapolu 10% obj.
8. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C przez 14 dni.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Płytki agarowe mykobakteryjne
Rosół Middlebrook 7H9	BD Difco	271310	Pożywka bulionowa mykobakteryjna
Cienkościenna rurka wirówkowa z polipropylenu 13x15 mm	Beckman Coulter	344059	Cienkościenna rurka wirówkowa z polipropylenu 13x15 mm
Termosy do filtracji próżniowej	Komórka Pro	V50022 powiedział:	Jednostka filtrująca