Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zawierających syderofory z Mycobacterium tuberculosis

Streszczenie

Źródło: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki z ograniczoną ilością żelaza. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film pokazuje stopniową izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Mycobacterium tuberculosis hodowanych w warunkach ograniczających żelazo, które naśladują środowisko gospodarza. Przedstawiono w nim zastosowanie ultrafiltracji, wirowania różnicowego i separacji gradientu gęstości w celu wzbogacenia i identyfikacji frakcji zawierających EV.

Protokół

1. Zbieranie mykobakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (MEV)

1. Zmierzyć OD₅₄₀ w 2 ml kultury w momencie pobierania. Wykonać seryjne rozcieńczenia kultury w stosunku 1:10 i podać 100 μl każdego rozcieńczenia na płytkach agarowych z ADN i 0,05% Tween-80.
2. Przenieść kulturę do pięciu stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 225 ml i wirować przy 2,850 x g przez 7 minut w temperaturze 20 °C.
3. Zebrać supernatant hodowli za pomocą pipety o pojemności 50 ml i wysterylizować go przez jednostkę filtrującą 0,22 μm.

2. Izolacja MEV

1. Przenieść filtrat hodowlany do systemu ultrafiltracji z mieszanymi komórkami umieszczonego w temperaturze 4 °C i przefiltrować koncentrat przy <50 psi przez membranę odcinającą 100 kDa do ~50 ml.
2. Odwirować zagęszczony filtrat kulturowy o sile 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant.
3. Odwirować filtrat kulturowy w probówkach ultrawirówek z poliwęglanu o sile 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
4. Zawiesić błoniaste granulki w objętości łącznie 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez delikatne pipetowanie.
5. Zmieszać 0,5 ml zawiesiny osadu otrzymanej w kroku 2.4 z 1,5 ml 60% roztworu jodiksanolu, uzyskując końcowe stężenie jodiksanolu wynoszące 45% wag./obj. Dozuj tę mieszaninę na dno cienkościennej probówki ultrawirówkowej z polipropylenu o wymiarach 13 mm x 51 mm.
6. Na zawiesinę MEV-jodixanol 45% nałożyć 1 ml roztworów jodiksanolu o stężeniu 1 ml roztworów 40%, 35%, 30%, 25% i 20% (obj. w PBS) oraz 1 ml PBS na górze.
7. Wirować przy 100 000 x g przez 18 godzin w temperaturze 4 °C.
8. Zbierz 1 ml frakcje gradientu gęstości, zaczynając od góry, za pomocą strzykawki Hamilton o pojemności 1 ml.
9. Rozcieńczyć każdą zebraną frakcję do 20 ml za pomocą PBS i odwirować przy 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
10. Usunąć supernatant i zawiesić osad w 0,5 ml PBS. Przechowywać ten granulat w temperaturze 4 °C.

Materiały