$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Szczepy bakteryjne i warunki hodowli
NUTA: Szczepy bakteryjne użyte w tym badaniu to Escherichia coli MP1, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve i Bifidobacterium dentium.
1. W przypadku E. coli należy użyć sterylnej pętli do zaszczepienia pojedynczych kolonii w 250 do 1 000 ml bulionu Luria-Bertani (LB) i inkubować tlenowo w inkubatorze z wytrząsaniem przy 300 obr./min i 37 °C przez 48 godzin przed przetworzeniem kultury. W przypadku rekombinowanego szczepu MP1 E. coli zawierającego p114-mCherryClyluc, dodać chloramfenikol do agaru LB i bulionu w końcowym stężeniu 17 μg/ml.
2. W przypadku A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve i B. dentium smugi na płytkach agarowych Brain Heart Infusion (BHI) i inkubować beztlenowo w komorze beztlenowej z winylu. Zaszczepić pojedyncze kolonie w 100 ml wstępnie zredukowanego bulionu BHI i inkubować beztlenowo przez 48 godzin.
2. Izolacja EV
1. Klarowanie pożywki bakteryjnej przez odwirowanie i filtrację
1. Przenieść kultury komórek bakteryjnych zaszczepione w kroku 1 do czystych butelek wirówek polipropylenowych o pojemności 250 ml lub 500 ml przez nalewanie. Odwirować butelki w rotorze o dużej pojemności i stałym kącie nachylenia w temperaturze 4 °C i 5 000 × g przez 15 minut. Przenieść supernatant do czystych butelek wirówkowych przez ostrożne nalewanie i ponownie odwirować przy 10 000 × g przez 15 minut.
NUTA: Butelki należy ponownie użyć po oczyszczeniu i odkażeniu odpowiednim dla bezpieczeństwa biologicznego.
1. Jeśli po drugim wirowaniu obecne są duże granulki komórek bakteryjnych, powtórz wirowanie w czystej butelce, aby dalej usuwać komórki.
2. Przenieść supernatant do urządzenia filtrującego o odpowiedniej wielkości z polieterosulfonu o odpowiedniej wielkości 0,22 μm przez wlanie. Filtrować, podłączając urządzenie filtrujące do ściennego źródła podciśnienia. Jeśli szybkość filtracji znacznie spadnie, po prostu przenieś niefiltrowany materiał do nowego urządzenia. Przefiltrowane podłoże należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C i w razie potrzeby kontynuować protokół następnego dnia.
NUTA: Powyższe wirowania zazwyczaj pozwalają na przetworzenie ~2x wskazanej objętości kultury komórkowej przez każde urządzenie. Na przykład pojedyncze urządzenie filtrujące o pojemności 500 ml może przefiltrować ~1,000 ml wstępnie odwirowanej kultury. Urządzenia te zazwyczaj nie są ponownie używane. Stosowanie filtrów strzykawkowych na tym etapie nie jest zalecane bez optymalizacji, ponieważ w testowanych modelach odnotowano znaczne straty. Jest to potencjalny punkt zatrzymania.
3. W tym momencie sprawdzić, czy komórki zdolne do życia zostały całkowicie usunięte, rozprowadzając podwielokrotność przefiltrowanego supernatantu na odpowiednich płytkach agarowych i upewnić się, że po inkubacji w warunkach optymalnych dla szczepu bakteryjnego nie ma żadnych kolonii. W przypadku wykrycia bakterii należy jeszcze bardziej zoptymalizować powyższą procedurę, wykonując dodatkowe wirowanie i/lub filtrację.
2. Stężenie przefiltrowanego podłoża
1. W przypadku pracy z objętościami znacznie >100 ml przejdź do kroku 2.2.2. W przypadku pracy z objętościami ~100 ml załadować 90 ml przefiltrowanej pożywki hodowlanej do zbiornika odśrodkowego urządzenia ultrafiltracyjnego o odpowiedniej pojemności 100 kDa (MWCO) za pomocą pipet serologicznych. Zawsze równoważyć za pomocą odpowiedniego urządzenia do ultrafiltracji i odwirowywać w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C i 2 000 × g w odstępach 15-30 minut, aż objętość pożywki w górnym zbiorniku zostanie zagęszczona do <0,5 ml.
1. Uzupełnij zbiornik pozostałą przefiltrowaną pożywką hodowlaną. W przypadku "doładowania" usuń przepływ w dolnej części urządzenia i ponownie zrównoważ wszystkie urządzenia.
NUTA: Zaobserwowano, że maksymalna objętość przefiltrowanej pożywki hodowlanej, którą można zagęścić za pomocą tych urządzeń, jest <2-krotnie większa od zalecanej objętości.
2. Jeżeli lepkość zagęszczonego podłoża w zbiorniku jest wyraźnie zwiększona (ciemny, lepki materiał), należy rozcieńczyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i ponownie zagęścić przez odwirowanie w celu rozcieńczenia wszelkich białek innych niż EV mniejszych niż MWCO 100 kDa.
NUTA: Jest to potencjalny punkt zatrzymania.
3. Przenieść skoncentrowaną pożywkę do probówki o niskiej wartości wiązania białka, przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc i w razie potrzeby kontynuować protokół następnego dnia.
2. W przypadku pracy z objętościami znacznie >100 ml, wybierz urządzenie do filtracji z przepływem stycznym (TFF) o odpowiedniej wielkości (100 kDa MWCO), aby dostosować się do objętości do przetworzenia.
NUTA: Urządzenia filtrujące do przetwarzania od 100 ml do >1,000 ml są dostępne na rynku. Lokalna dostępność, koszt i kompatybilność z pompą i przewodami/połączeniami będą decydować o tym, które modele będą najbardziej przydatne. Przed koniecznością wyczyszczenia filtra przetworzono do 2 l pożywki hodowlanej za pomocą urządzenia wskazanego w tabeli materiałów (patrz krok 2.3 poniżej, aby zapoznać się z protokołem czyszczenia).
1. Zmontuj obwód filtracji z rurką #16 o niskim poziomie wiązania/niskiego wypłukiwania, adapterami 1/8 cala z króćcem węża do Luer, urządzeniem TFF i pompą perystaltyczną.
NUTA: Wykonaj TFF w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia preparatu EV bakteriami środowiskowymi.
2. W temperaturze pokojowej rozpocząć cyrkulację przefiltrowanego, kondycjonowanego podłoża z prędkością około 200 ml/min (minimum 100 ml/min). Określ odpowiednią prędkość obrotową odpowiadającą pożądanemu natężeniu przepływu, pompując 200 ml PBS do naczynia z podziałką. Podczas cyrkulacji przefiltrowanego, kondycjonowanego środowiska, cząsteczki <100 kDa przechodzące przez membranę ultrafiltracyjną należy zebrać jako odpad w oddzielnym zbiorniku.
NUTA: W poniższym przykładzie założymy, że początkowa objętość kultury wynosi 2 litry.
3. Kontynuuj cyrkulację kondycjonowanej pożywki, aż jej objętość zostanie zmniejszona do ~ 100-200 ml. W razie potrzeby przenieś się na mniejsze naczynia. Rozcieńczyć 2-krotnie PBS i kontynuować cyrkulację za pomocą pompy, zagęszczając do 75-100 ml. Rozcieńczyć 2-krotnie PBS i kontynuować krążenie do końcowej objętości 25 ml. Rozcieńczyć 2-krotnie PBS i kontynuować krążenie do <10 ml.
4. Wyjmij rurkę zasilającą ze zbiornika próbki i kontynuuj pompowanie, aby oczyścić filtr i odzyskać maksymalną ilość próbki.
NUTA: Jest to potencjalny punkt zatrzymania.
5. Przenieść zagęszczoną próbkę do stożkowej probówki i w razie potrzeby przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Alternatywnie kontynuuj korzystanie z protokołu.
6. Przenieść zagęszczoną próbkę do odśrodkowego urządzenia ultrafiltracyjnego MWCO o pojemności 15 ml i pojemności 100 kDa. Wirować w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C i 2 000 × g w odstępach 15-30 minut, aż objętość pożywki w górnym zbiorniku zostanie zagęszczona do <2 ml.
NUTA: Jest to potencjalny punkt zatrzymania.
7. Przenieść skoncentrowaną pożywkę do probówki o niskiej wartości wiązania białek i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc, kontynuując protokół następnego dnia, jeśli jest to pożądane.