Transinfekcja bakteryjna limfocytów T in vitro poprzez tworzenie synaps immunologicznych

Streszczenie

Źródło: Cruz-Adalia, A., et al. Limfocyty T wychwytują bakterie przez transinfekcję z komórek dendrytycznych. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film pokazuje transinfekcję bakteryjną poprzez interakcje limfocytów T i komórek dendrytycznych specyficznych dla antygenu. Zakażone bakteriami komórki dendrytyczne prezentujące peptyd albuminy jaja kurzego są inkubowane z limfocytami T, bezpośrednio lub oddzielone błoną. Bezpośredni kontakt umożliwia tworzenie synaps immunologicznych, umożliwiając przenoszenie bakterii, podczas gdy błona zapobiega interakcji. Następnie przeprowadza się leczenie gentamycyną w celu wyeliminowania bakterii zewnątrzkomórkowych.

Protokół

Uwaga: Myszy były hodowane w pomieszczeniach wolnych od patogenów (SPF) i zostały poddane eutanazji przez przeszkolony i wykwalifikowany personel przy użyciu metody inhalacji dwutlenkiem węgla (CO_{2 ).}
1. Różnicowanie i infekcja komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego myszy (DCs)Uwaga: Rysunek 1 podsumowuje ten pierwszy krok. Od tego momentu wszystkie procedury powinny być wykonywane w kapturze, przy użyciu wyłącznie sterylnych pożywek, narzędzi, końcówek pipet i naczyń hodowlanych.

1. Różnicowanie DC pochodzących ze szpiku kostnego myszy
   1. Wypreparuj piszczele i kości udowe jednej myszy C57/BL6 i przenieś je do plastikowego naczynia z 10 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
   2. Odetnij każdą nasadę sterylnymi nożyczkami i odsłoń szpik kostny, który ma charakterystyczny jaskrawoczerwony kolor.
   3. Wprowadzić do wnętrza kości 10 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (bufor PBS/BSA/EDTA) za pomocą sterylnej strzykawki umieszczonej na sterylnej szalce Petriego.
   4. Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować w probówce o stężeniu 600 x g w wirówce z chłodzeniem (4 °C).
   5. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK) (0,15 M chlorku amonu (NH₄Cl), 10 mM wodorowęglanu potasu (KHCO₃) i 0,1 mM EDTA) i inkubować przez 30 sekund w temperaturze pokojowej (RT) w celu wyeliminowania czerwonych krwinek.
   6. Dodać 10 ml pożywki RPMI 1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i przefiltrować przez sitko komórkowe (70 μm) w celu usunięcia fragmentów kości i grudek komórek przed odwirowaniem z tą samą prędkością (600 xg), ponieważ grudki zostały wyeliminowane przez filtrowanie.
   7. Policz komórki i dostosuj do 5 x 10⁵ komórek/ml z RPMI 10% FBS (zawierającym 50 μM B-merkaptoetanolu, 1 mM pirogronianu sodu) i dodaj 20 ng / ml rekombinowanego mysiego czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (rm-GM-CSF) jako stężenie końcowe.
   8. Zawiesinę tę dodać do sterylnej, mikrobiologicznej szalki Petriego o średnicy 15 cm i wyhodować w inkubatorze CO₂ (37 °C, 5% CO_{2 ).}
   9. Co trzy dni odwirować zarówno nieprzylegające komórki, jak i odłączone komórki za pomocą 5 mM EDTA w PBS i ponownie zawiesić przy 5 x 10⁵ komórek/ml gęstości komórek, ze świeżą pożywką zawierającą 20 ng/ml rm-GM-CSF.
2. Dojrzewanie DC i ładowanie antygenów
   1. W 9 dniu ponownie zawiesić komórki o gęstości 5 x 10⁵ komórek/ml w pożywce zawierającej 20 ng/ml rm-GM-CSF. Następnie dodać 20 ng/ml lipopolisacharydu (LPS), aby umożliwić ekspresję wysokiego poziomu głównego kompleksu zgodności tkankowej lub MHC-II na komórkach i inkubować na sterylnej 15-centymetrowej szalce Petriego bez hodowli tkankowej przez 24 godziny.
   2. Po jednym dniu stymulacji LPS wybarwić niektóre komórki DC przeciwciałami przeciwko mysim CD11c, MHC-II i receptorowi granulocytów-1 lub Gr-1, aby sprawdzić różnicowanie DC za pomocą cytometrii przepływowej. Przykład analizy cytometrii przepływowej DC przedstawiono na rysunkach 3A i 3B.
      1. Inkubować DC (5 x 10⁵ komórek/próbkę) z przeciwciałem monoklonalnym anty-mysim-CD16/CD32 w stężeniu końcowym 2,5 μg/ml w 50 μl buforu PBS/BSA/EDTA na próbkę. Następnie dodaj 50 μl przeciwciał przeciwko MHC-II (I-A / I-E), CD11c i Gr-1 sprzężonych z różnymi fluorochromami odpowiednio w 1:100, 1:200 i 1:500 w buforze PBS / BSA / EDTA.
      2. Na koniec przemyć DC buforem PBS/BSA/EDTA i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie z protokołem producenta.
         Uwaga: Jeśli komórki są dobrze zróżnicowane, są gotowe do obciążenia antygenem.
   3. Przemyć DC RPMI 10% FBS (bez antybiotyków) i inkubować je z 10 μg/ml peptydu OTII owoalbuminy (OVAp) (OVA 323-339; I S Q A V H A A H A E I N E A G R) na plastikowej probówce w 1 ml pożywki RPMI 10% FBS na 5 x 10⁶ DC przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 ºC. Jako kontrolę ujemną pozostawić DC bez inkubacji z OVAp.
3. Zakażenie DC
   1. Infekować DC przy wielokrotności infekcji (MOI) 10 bakterii (10 bakterii na DC) przez 1 godzinę w inkubatorze CO₂ (37 °C, 5% CO₂).
   2. Umyj komórki DC 3x w PBS i 1x w RMPI 10% FBS i odwiruj przy 450 x g w celu umycia większości bakterii zewnątrzkomórkowych. Na koniec ponownie zawiesić komórki w pożywce RMPI 10% FBS (bez antybiotyków) w ilości 20 x 10⁶ komórek/ml.

2. Izolacja limfocytów T CD4 ⁺ od myszy transgenicznych OTIIUwaga: Rysunek 1 podsumowuje ten drugi krok. Do izolacji limfocytów T CD4 ⁺ należy użyć węzłów chłonnych zamiast śledziony, ponieważ udział limfocytów CD4 ⁺ w węzłach chłonnych (~50%) jest większy niż w śledzionie (~25%) i dlatego oczyszczanie byłoby bardziej skuteczne.

1. Wykonaj jednokomórkową zawiesinę węzłów chłonnych
   1. Usuń pachwinowe, pachowe, ramienne, szyjne i krezkowe węzły chłonne od transgenicznych myszy OTII i przenieś je do plastikowego naczynia z 10 ml pożywki RPMI 10% FBS.
   2. Zmiel węzły chłonne pod sterylnym kapturem za pomocą dwóch matowych szkiełek mikroskopowych. Umieść węzły chłonne na oszronionej stronie jednego szkiełka mikroskopowego i pocieraj matową stroną drugiego szkiełka, aż narządy zostaną zmielone.
   3. Przemyć zawiesinę jednokomórkową w buforze PBS/BSA/EDTA.
   4. Przefiltrować komórki przez sitko (70 μm) w celu usunięcia tkanki łącznej i przemyć buforem PBS/BSA/EDTA.
   5. Zawiesić komórki w 1 ml buforu do lizy ACK i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w celu wyeliminowania czerwonych krwinek.
2. Izolacja limfocytów T CD4⁺
   1. Umyj ponownie jak w kroku 2.1.3 i policz komórki, aby ponownie je zawiesić w 100 x 10⁶ komórek/ml w buforze PBS/BSA/EDTA. Dodaj biotynylowane przeciwciała przeciwko CD8, IgM, B220, CD19, MHC klasy II (I-Ab), CD11b, CD11c i DX5 w 1:250 przez 30 minut na lodzie w celu późniejszej negatywnej selekcji limfocytów T CD4 ⁺ .
   2. Umyć komórki w buforze PBS/BSA/EDTA i inkubować komórki (100 x 10⁶ komórek/ml) mikrogranulkami streptawidyny w stężeniu zalecanym w protokole producenta przez 15 min na lodzie.
   3. Umyj komórki w buforze PBS/BSA/EDTA i przefiltruj je przez sitko komórkowe (30 μm) przed izolacją limfocytów T CD4⁺ .
   4. Wyizolować limfocyty T CD4 ⁺ przez selekcję negatywną za pomocą magnetycznej maszyny do separacji komórek zgodnie z protokołem producenta.
   5. Policz komórki i dostosuj do 4 x 10⁶ komórek/ml z pożywką RPMI 10% FBS (bez antybiotyków).
   6. Zamocuj i trzymaj na lodzie izolowane limfocyty T CD4 ⁺ (3 x 10⁵ komórek), aby sprawdzić czystość za pomocą cytometru przepływowego. Przykład oczyszczania limfocytów T CD4 ⁺ pokazano na rysunku 3C.

3. Pomiar transinfekcji limfocytów T za pomocą testu ochrony gentamycynyUwaga: Rysunek 2 podsumowuje ten trzeci krok protokołu.

1. Transinfekcja limfocytów T

1. Inkubować izolowane limfocyty T CD4 ⁺ z zakażonymi komórkami DC (1: 1) (DC były zakażone przez 1 godzinę i myte w celu wyeliminowania wolnych bakterii) przez 30 minut, aby umożliwić tworzenie synaps immunologicznych w inkubatorze CO₂ (37 °C, 5% CO₂).

2. Dodać 0,5 ml wyizolowanych limfocytów T CD4 ⁺ (2 x 10⁶ komórek) i 0,1 ml zakażonych DC (2 x 10⁶ komórek) na 24-dołkowej płytce hodowlanej. Jako kontrolę negatywną należy zainfekować bezpośrednio 0,5 ml limfocytów T CD4 ⁺ w MOI 10 bakterii przez 30 minut.

3. Uwzględnij dodatkowe kontrole oddzielające zakażone DC od limfocytów T za pomocą poliwęglanowej bariery transwell (o wielkości porów 3 μm), utrudniającej fizyczny kontakt DC-T. Dodać 0,1 ml DC do transwella i 0,5 ml limfocytów T ^CD4+ do dolnej komory studzienki (płytka 24-dołkowa).

4. Na koniec uzupełnić pożywką RMPI, aż w każdym dołku będzie 0,6 ml, aby uzyskać równe objętości we wszystkich próbkach.

5. Po 30 minutach tworzenia synaps immunologicznych dodać 100 μg/ml gentamycyny i inkubować przez 1 godzinę przed zebraniem komórek w inkubatorze CO₂ (37°C, 5% CO₂ ).

Wyniki

Rysunek 1. Schemat blokowy wytwarzania prądu stałego i izolacji limfocytów T CD4⁺ . Po lewej stronie rysunku szczegółowo opisano proces różnicowania komórek dendrytycznych (DC) od komórek szpiku kostnego. Po wypreparowaniu kości u...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Prędkość obrotowa	Fisher Naukowy	SH3025501
r-GMCSF powiedział:	Peprotech	315-03
LPS	SIGMA	L2630-10mg
Na Pirogronian	Thermo Scientific	SH3023901
2-ME	Gibco (firma Gibco)	31350-010
OVAp OTII (323–339)	Język GenScript	---
Sitko komórkowe 70uM	BD	352350
30uM Strzykawka Filcons Sterylna	BD	340598
AutoMacs Klasyczny	Miltenyi Biotec	130-088-887
Gentamycyna	Normon powiedział:	624601.6
Studnia transwellowa	Costar	3415
FUNT	Pronadisa (Szczep Górski)	1231
Agar	Pronadisa (Szczep Górski)	1800
Paraformaldehyd 16%	Nauki o mikroskopii elektronowej	15710
Tryton X-100
Życiowiec CD8	BD Nauki biologiczne	553029
IgM Biot	Preparat ImmunoStep	Klon RMM-1
B220 Biot	BD Nauki biologiczne	553086
Biot CD19	BD Nauki biologiczne	553784
MHC-II Biot (I-A/I-E)	BD Nauki biologiczne	553622
Biot CD11b	Preparat Immunostep	11BB-01mg
Biot CD11c	Preparat Immunostep	11CB3-01mg tabletki powlekane
Biologia DX5	BD Nauki biologiczne	553856
Biot Gr-1	BD Nauki biologiczne	553125
CD16/CD32	Preparat ImmunoStep	Zobacz materiał M16PU-05MG
przeciw Salmonelli	ABD Serotec	8209-4006
CD11cPE	BD Nauki biologiczne	553802
CD4-APC (Przekaźnik APC)	Nauki biologiczne Tonbo	20-0041-U100
Transporter opancerzony Gr-1	BD Nauki biologiczne	553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC	BD Nauki biologiczne	553623
Alexa-Fluor 647 Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L), wysoce adsorbowane krzyżowo	Invitrogen	A-21245
CMAC (7-amino-4-chlorometylokokumaryna)	Technologie życiowe	Zobacz materiał C2110
BSA	SIGMA	A7030-100G
Mikrogranulki streptawidyny	Miltenyi Biotec	130-048-101
BD FACSCanto II	BD Nauki biologiczne	---