Test fototaksji sinic nitkowatych przy użyciu skupionego oświetlenia świetlnego

Streszczenie

Źródło: Weber, N. i wsp., Naturalna transformacja, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film przedstawia skoncentrowany test oparty na diodach LED do badania fototaksji u sinic nitkowatych. Bakterie migrują w kierunku źródła światła, tworząc gęstą akumulację w oświetlonym środku, która jest wizualizowana i określana ilościowo poprzez analizę intensywności pikseli przechwyconego obrazu.

Protokół

1. Test do fototaksji
   1. Do eksperymentów fototaksyjnych przygotuj oprawki na diody elektroluminescencyjne (LED) (tutaj z drukarką 3D), w których zamontowane są wybrane diody LED o średnicy 5 mm, które naświetlają obszar 20^mm2 od dołu do góry (Rysunek 1). W razie potrzeby użyj wielu oprawek LED równolegle, łącząc każdą diodę LED elektrycznie za pomocą rezystora i potencjometru z regulowanym zasilaczem. Zmierz i dostosuj intensywność diod LED w zależności od eksperymentu. Upewnij się, że całe ustawienie odbywa się w ciemnym pomieszczeniu lub zamkniętym, ciemnym pojemniku.
   2. Umieścić 8 ml pożywki zawierającej Phormidium lacuna na 6-centymetrowej szalce Petriego. Dostosuj natężenie światła diody LED. Zamknij szalkę Petriego pokrywką i umieść ją na uchwycie LED tak, aby dioda LED znajdowała się na środku szalki Petriego.
   3. Po upływie pożądanego czasu (zwykle 2 dni) uchwyć obraz szalki Petriego za pomocą kamery smartfona skierowanej bezpośrednio na pozycję leczenia światłem. Do naświetlania próbki należy użyć białego panelu LED. Skorzystaj z ręcznych ustawień aparatu; unikać odbić światła; Zawsze dostosowuj, aby uzyskać taką samą odległość między obiektywem aparatu a próbką. Upewnij się, że ustawienia ekspozycji dają obraz odpowiedni do późniejszych analiz przy użyciu ImageJ.
   4. Określ ilościowo średnicę środkowego okręgu włókien za pomocą oprogramowania ImageJ.
      1. Otwórz ImageJ, kliknij Plik | Otwórz, wybierz żądany plik i kliknij Enter.
      2. Wybierz przycisk Prosty (z linią prostą). Naciśnij lewy przycisk myszy, aby narysować linię od jednego końca szalki Petriego do przeciwległego końca. Upewnij się, że linia przechodzi przez środek okręgu włókien.
      3. Naciśnij Ctrl-K na klawiaturze lub kliknij pozycję Analizuj | Profil wydruku w menu ImageJ. Poszukaj okna x-y z intensywnością pikseli wykreśloną w funkcji odległości - profilu 1D szalki Petriego. Upewnij się, że najniższa intensywność pikseli jest nieco powyżej 0, a najwyższa wartość jest poniżej 255.
      4. Oszacuj średnią wartość intensywności pikseli poza okręgiem i inną średnią wartość intensywności pikseli w okręgu. W położeniu y między tymi wartościami oszacuj wartości x po obu stronach okręgu, wskazując myszą te pozycje. Zanotuj obie wartości i oblicz różnicę.
      5. Uzyskaj najwyższą wartość x, wskazując myszą oś y po prawej stronie. Zauważ, że ta wartość e reprezentuje średnicę szalki Petriego. Jeśli ta średnica wynosi 5 cm, oblicz średnicę środkowego okręgu żarnika jako d/e × 5 cm.

Wyniki

Rysunek 1: Eksperyment z fototaksją. Po lewej: Oprawka LED z 4 czerwonymi diodami LED, podłączona do regulowanego zasilacza. Na górze każdej diody LED znajduje się 6-centymetrowa szalka Petriego z 8 ml kultury Phormidium lacuna. Po prawej: szalka Petriego...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
szalki Petriego polistyren, 60 mm x 15 mm	Merck	P5481-500EA
Fotometr Nanodrop ND-1000	Peqlab Biotechnologie
Fotometr Uvikon XS	Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 10-100 μL	Gilson	Kod produktu: FA10004M
oprogramowanie, adres URL
ObrazJ		Oprogramowanie do przetwarzania obrazów (intensywność pikseli, średnica okręgu)
Pożywki hodowlane
f/2 -płynne medium	sztuczna woda morska, 0,1 % (v/v) roztwór pierwiastków śladowych, 0,05 % (v/v) roztwór witamin, 0,88 mM azotan sodu, 36 μM fosforan sodu