Ocena przyczepiania się pneumokoków do pierwotnych komórek śródbłonka człowieka przy stałym przepływie pożywki

Streszczenie

Źródło: Jagau, H. i wsp. Zakażenie Pneumokokami pierwotnych komórek śródbłonka człowieka w stałym przepływie. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film pokazuje wizualizację w czasie rzeczywistym przyczepiania się pneumokoków do sznurków czynnika von Willebranda (VWF) na komórkach śródbłonka w warunkach stałego przepływu pożywki. Przedstawiono w nim etapy stymulowania uwalniania VWF, znakowania strun i ilościowego określania wiązania bakterii.

Protokół

1. Indukcja uwalniania czynnika von Willebranda (VWF) i wizualizacja multimeryzowanych ciągów VWF

1. Utrzymuj ustawienie przepływu, ponieważ naprężenie ścinające 10 dyn/^cm2 jest wymagane do wyzwolenia multimeryzacji VWF do długich ciągów do 200 MDa. Indukować uwalnianie VWF ze śródbłonka WPB poprzez wstrzyknięcie 136 μl 100 mM roztworu podstawowego histaminy do pożywki do wzrostu komórek śródbłonka z mieszanką suplementów (ECGMS) - pożywką krążącą w rurkach perfuzyjnych za pomocą portu iniekcyjnego. Końcowe stężenie histaminy w środowisku przepływowym wyniesie 1 mM. Jeśli port do wstrzykiwań nie jest dostępny, histaminę można dodać alternatywnie, pipetując do pożywki w zbiornikach pompy.
2. W celu immunofluorescencyjnego wykrywania multimeryzowanych ciągów VWF, należy zatrzymać przepływ po osiągnięciu zrównoważonego poziomu pożywki w zbiornikach i wstrzyknąć 20 μg przeciwciała sprzężonego z izotiocyjanianem fluoresceiny specyficznym dla VWF (FITC) w objętości 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (pH 7,4) do krążących 13,6 ml pożywki ECGMS za pomocą portu iniekcyjnego. Jeśli port do wstrzykiwań nie jest dostępny, przeciwciało można dodać alternatywnie, pipetując do pożywki znajdującej się w zbiornikach pompy. Daje to końcowe stężenie przeciwciał 1,3 μg/ml.
3. Do skanowania mikroskopowego kilku pól widzenia w krótkim czasie należy użyć jednostki fluorescencyjnej mikroskopu z urządzeniem do fluorescencji ksenonowej o mocy 30% i kamerą epifluorescencyjną. Monitoruj kształt i morfologię warstwy ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) w trybie jasnego pola, aby wybrać reprezentatywne komórki odpowiednie do wizualizacji ciągów VWF.
4. Aby uwidocznić ciągi fluorescencji VWF na zielono, wybierz obiektyw olejowy 63x/1,40 i filtr detekcyjny 470 nm w menu jednostki fluorescencji w oprogramowaniu mikroskopu (LasX). Twórz migawki stosów Z z co najmniej 50 reprezentatywnymi widokami pola, z których każdy zawiera około 10 morfologicznie nienaruszonych HUVEC. W celu ilościowego określenia ciągów VWF z zielonej fluorescencji w różnych punktach czasowych należy zeskanować kilka pól widzenia.

2. Mikroskopowa ocena przyczepiania się bakterii do ciągów VWF w przepływie w czasie rzeczywistym

1. Ilościowe określenie przyczepiania się pneumokoków do strun VWF generowanych na powierzchni komórek HUVEC za pomocą detekcji immunofluorescencyjnej.
   1. Wstrzymać przepływ i wstrzyknąć 1,35 x 10⁸ jtk/ml pneumokoków wykazujących ekspresję białka czerwonej fluorescencji (RFP) w maksymalnej objętości 1 ml do pożywki ECGMS za pomocą portu iniekcyjnego. Alternatywnie, odpipetować bakterie do pożywki w zbiorniku pompy. Ponownie uruchomić naprężenie ścinające przy 10 dyn/^cm2 , aby bakterie mogły krążyć w układzie pompy.
   2. Wybierz 63-krotny obiektyw olejowy do powiększenia mikroskopu i dostosuj ustawienia filtra fluorescencyjnego w oprogramowaniu mikroskopu do kanału RFP (filtr detekcyjny 540 nm) w celu wykrywania pneumokoków wykazujących ekspresję RFP.
   3. W celu ilościowego określenia przyczepiania się bakterii do ciągów VWF, zatrzymaj przepływ i utwórz migawki stosów Z z co najmniej 30 reprezentatywnymi widokami pola, z których każdy zawiera około 10 morfologicznie nienaruszonych HUVEC, a następnie policz liczbę pneumokoków.
   4. W celu oceny danych należy użyć algorytmu statystyki jednoczynnikowej ANOVA, a następnie przeprowadzić post hoc dwustronny test próby niesparowanej w celu szczegółowego porównania statystycznego. Wartości P wynoszące <0,05 uznano za istotne statystycznie.

Materiały