Obrazowanie fluorescencyjne infekcji bakteryjnej związanej z biomateriałem w zarodkach danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Zhang, X., et al. Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Film przedstawia obrazowanie fluorescencyjne zarodków danio pręgowanego, którym wstrzyknięto Staphylococcus aureus, umożliwiając ilościowe określenie progresji infekcji i rozmieszczenia bakterii w celu oceny wpływu mikrosfer biomateriału na interakcje gospodarz-patogen in vivo.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Mikroskopia fluorescencyjna progresji infekcji i sprowokowanej infiltracji komórek w zarodkach danio pręgowanego

1. Znieczulić zarodki, umieszczając je na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 0,02% (w/v) kwasu 3-aminobenzoesowego (Trikaina) w celu ich znieczulenia. Po 5 minutach przenieść zarodki na płytkę agarozową pokrytą pożywką E3 zawierającą 0,02% (w/v) trikainy i ustawić je w jednej orientacji do wstrzyknięcia. Odpipetować 500 μl 2% (wag.) roztworu metylocelulozy PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem)-2% (wag.) na szalkę Petriego zawierającą pożywkę E3 z 0,02% (m/v) trikainą. Umieść zarodki w roztworze metylocelulozy i utrzymuj je prosto i poziomo.
   NUTA: Roztwór metylocelulozy jest stosowany jako "klej", który ze względu na swoją lepkość może tymczasowo unieruchomić zarodki w najlepszej orientacji do obrazowania.
2. Użyj stereomikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry jasnego pola, mCherry, białka zielonej fluorescencji (GFP) i UV (ultrafioletu), aby zobrazować poszczególne zarodki przy identycznych zoptymalizowanych ustawieniach (np. intensywności, wzmocnieniu i czasie ekspozycji) przy 160-krotnym powiększeniu. Ustaw płaszczyznę ogniskowej w taki sposób, aby uszkodzenie tkanki spowodowane wstrzyknięciem było ostre, używając filtra jasnego pola. Ustaw głębokość stosu Z na 10 μm i rozmiar kroku na 5 μm, co pozwala na rejestrację 3 kolejnych obrazów.
3. Obrazuj poszczególne zarodki raz dziennie od 5 godzin po wstrzyknięciu do 2 dni po wstrzyknięciu. Wykluczyć martwe zarodki (bez bicia serca lub zarodek częściowo zdegradowany) do dalszego obrazowania i analizy. Utrzymuj zarodki pojedynczo w pożywce E3 na płytkach 48-dołkowych. Odświeżaj podłoże codziennie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikrosfery polistyrenowe o średnicy 10 μm (niebieska fluorescencyjna)	Technologia życiowa/ThemoFisher	F8829 powiedział:
Kwas 3-aminobenzoesowy (Trikaina)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny LM80	Księga Leica	MDG3610450126
Metyloceluloza 4000cp	Sigma-Aldrich	MO512-250G
Szalka Petriego	Sokół	353003
Szalka Petriego	Biomérieux	NL-132
ObrazJ	Nie dotyczy	Nie dotyczy	Link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0 (wersja 19.0)	Pryzmat	Nie dotyczy