Analiza in vivo zakażeń bakteryjnych związanych z implantami przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Zhang, X. i wsp., Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film przedstawia model zarodka danio pręgowanego do badania infekcji związanych z wszczepionymi biomateriałami. Wstrzykiwanie Staphylococcus aureus mikrosferom polistyrenowym zwiększa przeżywalność bakterii, potwierdzając rolę wszczepionych materiałów w promowaniu infekcji.

Protokół

1. Przygotowanie zawiesin zawierających tylko bakterie i mikrosfery bakteryjne

NUTA: Stosowany jest szczep Staphylococcus aureus RN4220 wykazujący ekspresję białka fluorescencyjnego mCherry (S. aureus-mCherry). Szczep S. aureus RN4220 jest zmutowany w genie regulatora wirulencji agrA (dodatkowy regulator genu A), a zatem może mieć stosunkowo niską zjadliwość w modelu zarodka danio pręgowanego. Można stosować inne szczepy S. aureus lub inne gatunki bakterii do infekcji związanych z biomateriałem (BAI).

1. Pobrać od 4 do 5 kolonii bakterii S. aureus RN4220 z tryptycznych płytek hodowlanych agaru sojowego uzupełnionych 10 μg/ml chloramfenikolu i wyhodować bakterie do środkowej logarytmicznej fazy wzrostu w 10 ml tryptycznego bulionu sojowego uzupełnionego 10 μg/ml chloramfenikolu w temperaturze 37 °C pod wstrząsem.
   1. Podczas hodowli rozcieńczyć 100 μl zawiesiny bakteryjnej w 900 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w kuwecie (szerokość 1 cm) w celu pomiaru gęstości optycznej (OD) przy 620 nm (OD₆₂₀). Hoduj bakterie, aż OD₆₂₀ osiągnie 0,4–0,8.
      NUTA: OD₆₂₀ wynoszący 0,1 na ogół odpowiada jednostce tworzącej kolonię (CFU) x 10⁷ / ml S. aureus. OD₆₂₀ inokulum bakterii w środkowej logarytmicznej fazie wzrostu wynosi od 0,4 do 0,8. W przypadku innych gatunków i szczepów bakterii mogą być potrzebne różne okresy hodowli.
2. Odwirować bakterie przy 3 500 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić granulowane bakterie w 1 ml sterylnego PBS. Następnie przemyj bakterie sterylnym PBS 2 razy, a na koniec ponownie zawiesić bakterie w 1,1 ml 4% (w/v) roztworu poliwinylopirolidonu40 (PVP40) w PBS.
3. Zwirować tę zawiesinę bakteryjną i rozcieńczyć 100 μl zawiesiny w 900 μl sterylnego PBS w kuwecie do pomiaru OD₆₂₀ . Dostosuj stężenie zawiesiny bakteryjnej roztworem PVP40. Jest to zawiesina "Tylko bakterie".
4. Biomateriały można dowolnie dobierać do mieszania z zawiesiną bakteryjną. W niniejszej pracy wykorzystano komercyjne mikrosfery polistyrenowe (PS) (niebieska fluorescencja, 10 μm). Aby wytworzyć zawiesinę mikrosfer bakterii, należy odwirować mikrosfery przez 1 minutę w temperaturze 1 000 x g w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić mikrosfery w zawiesinie "tylko bakterie" (w roztworze PVP40).
5. Aby wstrzyknąć w przybliżeniu równe dawki bakterii w obecności i przy braku mikrosfer, stężenie zawiesiny bakterii-mikrosfer musi wynosić dwie trzecie stężenia zawiesiny "tylko bakterie" (bez mikrosfer). Osiąga się to poprzez rozcieńczenie zawiesiny mikrosfer bakterii 0,5 objętości roztworu PVP40. Wymieszaj zawiesiny przez wirowanie. Warto zauważyć, że stosunek ten (dwie trzecie) został oceniony dla S. aureus. Jest on również odpowiedni dla S. epidermidis, ale zaleca się sprawdzenie, czy stosunek ten dotyczy również innych gatunków bakterii i innych rozmiarów (niż 10 μm) lub kształtów biomateriałów (niż mikrosfery), które mają być wstrzykiwane.
6. Sprawdzić stężenie zawiesiny "tylko bakterie" i mikrosfery bakterii poprzez ilościową hodowlę 10-krotnych rozcieńczeń seryjnych, jak poniżej: przenieść 100 μl zawiesin na płytkę 96-dołkową i seryjnie rozcieńczyć, przenosząc 10 μl podwielokrotności zawiesiny do 90 μl sterylnego PBS. Na płytkach agarozowych powielić 10 μl podwielokrotności nierozcieńczonych i rozcieńczonych zawiesin, inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc, policzyć kolonie i obliczyć liczbę bakterii (jednostek tworzących kolonie, CFU).

2. Hodowla, zbiór i utrzymanie zarodków danio pręgowanego

1. Postępuj zgodnie z ogólnymi procedurami hodowli, zbioru i utrzymania zarodków danio pręgowanego, z modyfikacjami opisanymi poniżej. Skrzyżuj rodzinę dzikich typów Tupfel długopłetwy (TL) danio pręgowanego lub danio pręgowanego wybranej linii transgenicznej (tutaj, Mpeg1: Kaede) w zbiorniku z dodaną siatką, aby skłonić dorosłe samice do produkcji jaj po włączeniu światła, a następnie oddzielić dorosłe osobniki od wyprodukowanych jaj.
2. Następnego dnia zbierz zarodki i wyrzuć te nieprzezroczyste, które nie są zdolne do życia. Przechowywać około 60 zarodków na szalce Petriego (o średnicy 100 mm) w pożywce E3 i inkubować w temperaturze 28 °C. Usunąć martwe i nieprawidłowe zarodki i codziennie odświeżać pożywkę E3.

3. Przygotowanie igieł iniekcyjnych

1. Przygotować szklane igły mikrokapilarne do wstrzykiwań za pomocą ściągacza do mikropipet. Użyj następujących ustawień: ciepło: 772, uciąg: 100, vel: 200, czas: 40, gaz: 75.
2. Przełamać końcówkę igły kleszczami w miejscu, w którym igła ma średnicę zewnętrzną około 20 μm (dla mikrosfer 10 μm), używając mikroskopu świetlnego ze skalą w okularze. Unikaj igieł o bardzo dużym rozmiarze otworu, ponieważ zagrażają one przetrwaniu zarodków.
   NUTA: Otwór może być mniejszy lub większy, w zależności od wielkości i kształtu biomateriałów, które mają być wstrzykiwane. W piśmiennictwie donoszono, że wstrzyknięcia przy użyciu igieł o otworze około 50 μm powodują znaczne zmniejszenie przeżywalności zarodków.

4. Wstrzykiwanie zawiesiny samych bakterii lub mikrosfer bakteryjnych do zarodków danio pręgowanego

1. Podgrzej roztwór agarozy (1–1,5% (wag.) w demi-wodzie) za pomocą kuchenki mikrofalowej i wlej do 100-milimetrowej szalki Petriego. Umieść plastikowy szablon formy na roztworze agarozy na szalce Petriego, aby utworzyć wgłębienia w agarozie w celu umieszczenia zarodków we właściwych pozycjach i ułatwienia wstrzyknięć. Inkubować w temperaturze pokojowej i usunąć pleśń, gdy roztwór agarozy zastygnie.
2. W 3 dni po zapłodnieniu umieść zarodki na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 0,02% (w/v) kwasu 3-aminobenzoesowego (Trikaina) w celu ich znieczulenia. Po 5 minutach przenieść zarodki na płytkę agarozową pokrytą pożywką E3 zawierającą 0,02% (w/v) trikainy i ustawić je w jednej orientacji do wstrzyknięcia. W przypadku Mpeg1: linia transgeniczna Kaede najpierw znieczula zarodki w pożywce E3 zawierającej 0,02% (w/v) trikainy. Następnie wybierz zarodki wykazujące ekspresję zielonych białek fluorescencyjnych za pomocą stereomikroskopowego mikroskopu fluorescencyjnego.
3. Napełnić igłę około 10 μl zawiesiny "Tylko bakterie" lub "Bakterie-mikrosfery" za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki. Zamontuj igłę na mikromanipulatorze podłączonym do mikrowtryskiwacza. Dla zastosowanego tutaj wtryskiwacza (patrz Tabela materiałów) należy zastosować następujące ustawienia dla iniekcji 2–3 nL: ciśnienie: 300–350, ciśnienie wsteczne: 0, czas: 2 ms. UWAGA: Ustawienia mikrowtryskiwacza zależą od zastosowanego wtryskiwacza. Może być konieczne dostosowanie ustawień wtryskiwacza do wstrzykiwań bakterii zmieszanych z biomateriałami o innych kształtach lub rozmiarach.
   1. Do wstrzykiwania zawiesiny "Tylko bakterie" i zawiesiny mikrosfer należy używać igieł z tym samym otworem. Jeśli igła jest złamana lub zatkana, należy zawsze wymienić igłę na nową do dalszych wstrzyknięć.
4. Wprowadzić igłę do tkanki mięśniowej zarodków pod mikroskopem świetlnym (ryc. 1), pod kątem 45–60° między igłą a ciałem zarodka. Dostosuj położenie igły w tkance, delikatnie przesuwając ją do przodu i do tyłu. Wstrzyknąć zarodki za pomocą pedału nożnego podłączonego do mikrowstrzykiwacza.
5. Po wstrzyknięciu bakterii fluorescencyjnych należy ocenić zarodki pod kątem udanej infekcji pod mikroskopem stereofluorescencyjnym. Wyrzuć zarodki z wynikiem ujemnym (brak widocznych bakterii fluorescencyjnych lub brak widocznych mikrosfer fluorescencyjnych). Utrzymuj zarodki pojedynczo w pożywce E3 na płytkach 48-dołkowych. Odświeżaj podłoże codziennie.

5. Miażdżenie zarodków, punktacja mikroskopowa i ilościowa hodowla bakterii

1. Oceń wszystkie zarodki pod mikroskopem pod kątem obecności bakterii fluorescencyjnych za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego, zaczynając natychmiast po wstrzyknięciach i każdego kolejnego dnia, aż zarodki zostaną losowo wybrane do hodowli ilościowej.
2. Losowo wybierz kilka żywych zakażonych zarodków (od 5 do 6 w niniejszym badaniu) wkrótce po wstrzyknięciu i przenieś je pojedynczo do oddzielnych mikroprobówek o pojemności 2 ml za pomocą sterylnych końcówek. Usunąć pożywkę, delikatnie umyć zarodki sterylnym PBS i dodać 100 μl sterylnego PBS.
3. Dodać 2-3 sterylne kulki cyrkonu (o średnicy 2 mm) do każdej fiolki i rozdrobnić zarodki za pomocą homogenizatora (patrz Tabela Materiałów) z prędkością 3500 obr./min przez 30 s. Wyhodować homogenat ilościowo, jak opisano w kroku 1.3.
   NUTA: Inne homogenizatory mogą wymagać innych ustawień.
4. Losowo wybierz wiele zarodków w kolejnych dniach po wstrzyknięciu do hodowli ilościowej zgodnie z krokiem 5.3.

Wyniki

Rycina 1: Schematyczna procedura jednoczesnego wstrzykiwania zawiesiny mikrosfer bakteryjnych do mięśnia ogonowego zarodków danio pręgowanego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar sojowy tryptyczny	BD Difco	236950	Dział przygotowania pożywek w AMC
Tryptyczny bulion sojowy	BD Difco	211825
Poliwinylopirolidon 40	Aplikacja	A2259.0250
Mikrosfery polistyrenowe o średnicy 10 μm (niebieska fluorescencyjna)	Technologia życiowa/ThemoFisher	F8829 powiedział:
Mikrokapilarz szklany (średnica zewnętrzna 1 mm x średnica zewnętrzna 0,78 mm)	Aparatura Harvarda	30-0038
Przyrząd do ściągania mikropipet	Sutter Instrument Inc	Płonący p-97
Mikroskop świetlny LM 20	Księga Leica	MDG33 10450123
Kwas 3-aminobenzoesowy (Trikaina)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Poseł z Agarozy	Roche	11388991001
Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny LM80	Księga Leica	MDG3610450126
Końcówki do pipet do mikroładowarek	Eppendorf powiedział:	5242956.003
Mikromanipulator M3301 ze statywem M10	Światowe instrumenty precyzyjne	00-42-101-0000
Mikrowtryskiwacz ekspresowy FemtoJet	Eppendorf powiedział:	5248ZO100329 powiedział:
Mikrotrub 2ml pp	Sarstedt powiedział:	72.693.005
Koraliki cyrkonowe	Połączenie biologiczne	11079124ZX
Lizer MagNA	Roche	41416401
Chloramfenikol	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C0378 powiedział:
Wytrząsarka żyroskopowa (do rozwoju bakterii)	Naukowy Nowy Brunszwik	G10 powiedział:
Inkubator danio pręgowanego	Firma VWR	Linia Incu-line
Kuwety	MARKA	759015
Wirówka	Hettich-Zentrifugen	ROTANTA 460R
Spektrometr	Farmacja biotechnologiczna	Ultrospec®2000
Kleszcze	Sigma-Aldrich	F6521-1EA
48 dołków na płytki	Greiner bio-one	677180
96 płytek dołkowych	Greiner bio-one	655161
Szalka Petriego	Sokół	353003
Szalka Petriego	Biomérieux	NL-132