Przygotowanie jednokomórkowego inokulum bakteryjnego

Streszczenie

Źródło: Niu, L., et al., Wizualizacja śmierci komórek litycznych makrofagów podczas infekcji mykobakteryjnej w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii przyżyciowej. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film przedstawia przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej Mycobacterium marinum z hodowli w późnej fazie logarytmicznej do konsekwentnego stosowania w testach infekcji i dalszych zastosowaniach.

Protokół

1. Preparat inokulum jednokomórkowego Mycobacterium marinum (ryc. 1)

1. Rozmrozić cyruliańsko-fluorescencyjny wywar glicerolowy Mycobacterium marinum z -80 °C i zaszczepić płytkę agarową 7H10 10% (v/v) OADC (kwas oleinowy, albumina, dekstroza, katalaza), 0,25% glicerolu i 50 μg/ml higromycyny. Inkubować płytkę w temperaturze 32 °C przez około 10 dni.
2. Wybierz kolonię wykazującą dodatnią fluorescencję i zaszczep 3 ml pożywki 7H9 10% OADC, 0,5% glicerolu i 50 μg/ml higromycyny.
   1. Inkubować inokulację w temperaturze 32 °C i 100 obrotach na minutę (obr./min) przez 4–6 dni, aż kultura osiągnie fazę logarytmiczną (OD₆₀₀ = 0,6–1,0).
   2. Subkultura (1:100) w 30 ml świeżej pożywki 7H9 z 10% OADC, 0,5% glicerolu, 0,05% Tween-80 i 50 μg/ml, aż OD₆₀₀ osiągnie ~1,0.
      NUTA: W tym momencie zalecany jest etap subkultury, aby uzyskać najwyższą jakość kultury. Z naszego doświadczenia wynika, że dodanie klonu bezpośrednio do dużej objętości podłoża doprowadzi do powstania grudek bakteryjnych.
3. Zbierz komórki M. marinum zgodnie z poniższym opisem.
   1. Wirować przy 3 000 x g przez 10 minut, aby zebrać M. marinum w postaci granulatu. Wyrzucić wszystko, z wyjątkiem 300 μl supernatantu i użyć go do ponownego wymieszania osadu.
   2. Dodać 3 ml pożywki 7H9 z 10% glicerolem w celu dalszego zawieszenia granulki, a następnie sonikować zawiesinę w łaźni wodnej o mocy 100 W przez 15 s ON, 15 s OFF przez łącznie 2 min.
      NUTA: Sonikacja jest stosowana w celu uzyskania jednokomórkowego homogenatu dla inokulum, co zapobiega zablokowaniu igły do mikroiniekcji.
4. Przenieść zawiesinę bakteryjną do strzykawki o pojemności 10 ml i przepuścić ją przez filtr 5 μm w celu usunięcia grudek.
5. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) zawiesiny za pomocą spektrofotometru i rozcieńczyć ją do OD₆₀₀ = 1,0 za pomocą pożywki 7H9 zawierającej 10% glicerolu. Podzielić zawiesinę na 10 μl porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C w zamrażarce do wykorzystania w przyszłości.
6. Potwierdzić stężenie bakteryjne inokulum (jtk/ml) przez seryjne rozcieńczanie i posiewanie materiału bakteryjnego na płytce agarowej 7H10 zawierającej 10% (v/v) OADC, 0,5% glicerolu i 50 μg/ml higromycyny.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat ideowy przygotowania bakterii jednokomórkowych . Jednokomórkowe stada Mycobacterium marinum zostały wygenerowane zgodnie z opisanym procesem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% Animacja-80	Sigma	Zobacz materiał P1379 powiedział:
Strzykawka 10 ml	Solarbio (Słoneczna Biologia)	YA0552 powiedział:
10% OADC	BD	211886
Filtr 5 μm	Mille X	SLSV025LS
50 μl/ml higromycyny	Sangon Biotechnologia	A600230
7 godz. 10	BD	262710
7H9 powiedział:	BD	262310
Izba środowiskowa	Pecon powiedział:	Regulator temperatury 37-2 cyfrowy
Mikroładowarka Eppendorf	Eppendorf powiedział:	5242956003
Glicerol	Sangon Biotechnologia	A100854
Inkubator	Stępka	PH-140(A)
Mycobacterium marinum (Mycobacterium marinum)			ATCC BAA-535
Sonifikacji	SCICNTZ	JY92-IIDN
Spektrofotometr (OD600)	Eppendorf AG	22331 Hamburg