Transfekcja ludzkich neuralnych komórek macierzystych za pomocą nukleofektora Amaxa

Podsumowanie

Wprowadzenie interesującego genu do komórki jest potężną metodą wyjaśniania jego funkcji in vivo. Niniejszy protokół opisuje wydajną metodę transfekcji hodowli ludzkich neuralnych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPCs) przy użyciu aparatu do elektroporacji Nucleofector firmy Amaxa.

Streszczenie

Transfekcja pierwotnych komórek neuronalnych ssaków, takich jak ludzkie komórki macierzyste/prekursory neuronalne (hNSPCs), z użyciem powszechnie stosowanych kationowych lipidowych odczynników do transfekcji często skutkowała słabą żywotnością komórek i niską wydajnością transfekcji. Inne mechaniczne metody wprowadzania interesującego genu, takie jak „armatka genowa” (gene gun) lub mikroiniekcja, są również ograniczone przez niską żywotność komórek i niewielką liczbę przetransfekowanych komórek. Strategia wykorzystania konstruktów wirusowych do wprowadzania egzogennego genu do komórek pierwotnych była ograniczona zarówno nakładem czasu i pracy niezbędnym do stworzenia wektorów wirusowych, jak i potencjalnymi kwestiami bezpieczeństwa. Opisujemy tutaj szczegółowy protokół transfekcji hNSPCs przy użyciu urządzenia i technologii Nucleofector firmy Amaxa, z parametrami prądu elektrycznego i roztworami buforowymi zoptymalizowanymi specjalnie pod kątem transfekcji neuronalnych komórek macierzystych. Stosując ten protokół, osiągnęliśmy początkową wydajność transfekcji na poziomie ~35% oraz ~70% po transfekcji stabilnej. Protokół polega na połączeniu dużej liczby hNSPCs z DNA przeznaczonym do transfekcji w odpowiednim buforze, a następnie przeprowadzeniu elektroporacji za pomocą urządzenia Nucleofector.

Protokół

Uwaga: Należy zapoznać się z artykułem Passaging Human Neural Stem Cells (https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263) oraz artykułem Counting Human Neural Stem Cells (https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262), aby dowiedzieć się, jak resuspenderować i liczyć hNSPCs.

Przygotowanie

1. Upewnij się, że dostępna jest wystarczająca liczba komórek do transfekcji (kilka milionów komórek dla każdego transfekowanego DNA).
2. Przeddzień transfekcji pokryj naczynie do hodowli tkankowej, do którego zostaną wysiane transfektowane komórki, ludzką fibronektyną w stężeniu 10 µg/ml. Bezpośrednio przed rozpoczęciem protokołu transfekcji usuń fibronektynę, wypłucz naczynie PBS i wlej do niego pożywkę hodowlaną. Pozostaw naczynie w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37°C, aby podgrzać pożywkę. Dodatkowo umieść w inkubatorze 1 ml pożywki hodowlanej, aby wstępnie ogrzać ją do 37°C.
3. Umieść DNA przeznaczone do transfekcji oraz roztwór do transfekcji (firmy Amaxa) na lodzie.

Transfekcja

1. Przemyj określoną liczbę komórek roztworem PBS (zazwyczaj stosujemy ~ 5 x 106 komórek na jedną transfekcję). Odwiruj komórki w wirowarce (1000 rpm (~200xg) przez 5 minut), odlej jak największą ilość PBS i resuspender osad komórkowy w 100 µl roztworu do transfekcji dostarczonego w zestawie. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,7 ml.
2. Dodaj 5 µl DNA (~5-10 µg DNA na jedną transfekcję) do zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszaj.
3. Za pomocą mini-pipety Amaxa przenieś mieszaninę komórek i DNA do kuwety do transfekcji Amaxa. Przygotuj 1 ml podgrzanej pożywki hodowlanej do następnego kroku. Wyjmij również z inkubatora naczynie z pożywką hodowlaną i umieść je w dygestorium do hodowli tkanek.
4. Włóż kuwetę do Nucleofektora, obróć pokrętło zgodnie z ruchem wskazówek zegara i wybierz program „A-033”. Naciśnij Enter.
5. O pomyślnym przebiegu transfekcji świadczy obecność bardzo gęstej warstwy pęcherzyków powietrza na powierzchni roztworu w kuwecie. Dodaj do kuwety 500 µl ciepłej pożywki, a następnie za pomocą mini-pipety Amaxa przenieś transfekowane komórki do naczynia z podgrzaną pożywką. Przepłucz kuwetę kolejną porcją ciepłej pożywki i dodaj płuczkę do tego samego naczynia. Umieść naczynie z komórkami w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje stosunkowo szybką i wydajną procedurę transfekcji hNSPCs. Stosując tę procedurę, uzyskaliśmy początkową wydajność transfekcji na poziomie ~35%. Komórki poddane transfekcji tą metodą mogą być wykorzystywane w badaniach krótkoterminowych (komórki przejściowo transfekowane) lub w badaniach długoterminowych, jeśli zastosowany zostanie czynnik selekcyjny w celu wytworzenia stabilnie transfekowanej populacji. Otrzymaliśmy stabilnie transfekowane komórki, w których ~70% populacji wykazuje ekspresję bi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Urządzenie Nucleofector	Narzędzie	Amaxa	AAD-1001
Zestaw do nukleofekcji mysich neuralnych komórek macierzystych	Odczynnik	Amaxa	VPG-1004