$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
- Inokulacja zwierząt szczepami bakteryjnymi przez wstrzyknięcie
- Rano w dniu wstrzyknięcia należy usunąć kriowiale badanych szczepów bakteryjnych i rozmrażać je w temperaturze 4 °C przez 3-4 godziny. Rozmrozić 0,5 ml dla każdej myszy, która zostanie wstrzyknięta. Po rozmrożeniu fiolki należy przechowywać na lodzie i wstrzyknąć myszom w ciągu 2 godzin.
- Po rozmrożeniu przenieś każdy kriowial do nowej probówki o pojemności 2 ml i odwiruj przy 4,500 x g przez 10 minut, odrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 1 ml 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).
- Ponownie odwirować przy 4 500 x g przez 10 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1x PBS do końcowego stężenia 2,5 x 109 CFU/ml (CFU: jednostki tworzące kolonie). Dokładna ilość użytego 1x PBS będzie się nieznacznie różnić w zależności od szczepu.
- Pobrać 3 próbki z końcowej zawiesiny każdego szczepu, aby zwalidować CFU/ml, genotyp i fenotyp, jak opisano powyżej.
- Dla każdego szczepu należy podać 1,5 ml zawiesiny PBS/komórkę do jednej probówki o pojemności 2 ml na 5 myszy, aby ograniczyć liczbę włożenia probówki. Należy również przygotować probówki z 1x PBS do wstrzyknięć kontrolnych.
- Zbierz myszy (10 samców i 10 samic C57BL/6 na grupę w tym eksperymencie) i materiały potrzebne do wstrzykiwań (strzykawki, igły, pojemniki na ostre przedmioty, markery, długopis i papier itp.). Przenieś się do sterylnej sali operacyjnej dla zwierząt. Wytrzyj wszystkie powierzchnie chusteczkami odkażającymi.
- Aby wyeliminować stres i ryzyko zranienia eksperymentatora, przyprowadź tylko jedną płeć i grupę eksperymentalną myszy do sali operacyjnej na raz (np. grupę 10 samców myszy, które mają zostać zarażone określonym szczepem). Noś dwie pary rękawic lateksowych, aby wyeliminować przebicie rękawic w przypadku ugryzienia. Noś fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i maskę na twarz, aby uniknąć zanieczyszczenia.
- Rozpocząć wstrzykiwanie grupy kontrolnej od 1x PBS. Pozwoli to ustalić, czy jakiekolwiek działania niepożądane wynikają z samego wstrzyknięcia.
- Wyjmij mysz z klatki. Usuwaj tylko jedną mysz na raz.
- Zważ mysz i oznacz jej ogon trwałym markerem, aby śledzić utratę wagi po wstrzyknięciu.
- Otwórz nową strzykawkę o pojemności 1 ml i igłę 27 G (użyj nowej strzykawki i igły dla każdej myszy, aby wyeliminować zanieczyszczenie) i wstrzyknąć 200 μl sterylnego 1x PBS.
- Chwyć mysz za uszami za pomocą kciuka i palca wskazującego. Uszczypnij, aby utworzyć fałd skórny na karku, aby się go trzymać - ciaśniejszy fałd zmniejsza ruchy szyi i ryzyko ugryzienia podczas wstrzyknięcia. Przymocuj ogon do dłoni za pomocą małego palca, aby utrzymać mysz płasko przy niewielkim ruchu.
- Odwróć mysz i włóż igłę pod kątem 30° do jamy otrzewnej po lewej lub prawej stronie linii środkowej. Po wkłuciu igły należy lekko unieść, aby upewnić się, że została wprowadzona w obszar dootrzewnowy, a nie do narządów. Powoli wstrzyknąć PBS, a następnie wyjąć igłę.
- Umieść zużytą igłę w wyznaczonym pojemniku na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne. Nie używać ponownie strzykawki lub igły. Typowy jest bolus w miejscu wstrzyknięcia.
- Po wstrzyknięciu należy przenieść mysz do osobnej klatki.
- Powtórz procedurę z następną myszką. Po wstrzyknięciu wszystkich myszy z jednej klatki należy natychmiast umieścić je z powrotem w pierwotnej klatce.
- Po wstrzyknięciu grupy kontrolnej należy rozpocząć wstrzykiwanie zawiesin szczepów, które mają być badane, zgodnie z tą samą procedurą.
- Wstrzyknąć 200 μl zawiesiny komórek. Zaczynając od zawiesin komórkowych 2,5 x 109 CFU/ml, każda mysz otrzymuje 5 x 108 CFU.
NUTA: Stężenia te zostały zoptymalizowane na podstawie wstępnych badań na zwierzętach w celu określenia śmiertelnych dawek każdego szczepu. Może być konieczne dostosowanie dawkowania do innych szczepów/gatunków.
- Po zakończeniu wszystkich wstrzyknięć należy zwrócić myszy do pomieszczenia mieszkalnego, aby złagodzić stres. Oczyść miejsce pracy chusteczkami odkażającymi.
- Monitorować zwierzęta pod kątem śmiertelności po wstrzyknięciu, sprawdzając klatki pod kątem martwych myszy co 3 godziny przez 72 godziny i co 12 godzin przez 10 dni. Rejestruj wagę myszy co 12 godzin, aby określić utratę wagi z powodu choroby.