Generowanie podwójnie krzyżowanych rekombinantów Pseudomonas aeruginosa w celu celowanej delecji genów

Streszczenie

Źródło: Valentine, M. E., et al. Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa i testowanie tłumienia wirulencji w prostym mysim modelu infekcji. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film pokazuje generowanie rekombinantów podwójnie krzyżowych w Pseudomonas aeruginosa przy użyciu strategii delecji genów opartej na plazmidzie. Proces ten polega na selekcji bakterii, które zawierają niereplikacyjny plazmid zintegrowany z genomem poprzez pojedyncze skrzyżowanie, a następnie wywołaniu drugiego zdarzenia rekombinacji pod selekcją sacharozy w celu wycięcia plazmidu. Udana rekombinacja podwójnej krzyżówki jest potwierdzona utratą oporności na antybiotyki i zdolności do wzrostu na pożywkach zawierających sacharozę.

Protokół

1. Wykrywanie podwójnie krzyżowanych rekombinantów P. aeruginosa

1. Dla każdej kultury bulionowej zaszczepij 10 μl kultury na wstępnie podgrzanej płytce PIA (Pseudomonas Isolation Agar) uzupełnionej 10% sacharozą (bez glicerolu) i smugą dla izolowanych kolonii. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Następnego dnia wyjmij płytki z inkubatora i sprawdź je pod kątem wzrostu. Kolonie odporne na sacharozę powinny być rekombinantami podwójnie krzyżowymi (tj. usunąć plazmid z chromosomu poprzez zdarzenie rekombinacji między innym homologicznym regionem wstawki plazmidu a chromosomem P. aeruginosa ).
   1. Nałóż co najmniej 20 kolonii sterylnymi wykałaczkami na wstępnie podgrzane płytki: 1) PIA, 2) PIA uzupełnione 10% sacharozą (bez glicerolu) i 3) PIA uzupełnione 300 μg/ml karbenicyliny.
3. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
4. Wyjmij płytki z inkubatora i zbadaj je pod kątem wzrostu. Prawdziwe rekombinanty podwójnie krzyżowe będą wrażliwe na karbenicylinę i odporne na sacharozę (tj. kolonie, które rosły na PIA i PIA uzupełnione sacharozą, ale nie rosły na PIA uzupełnione karbenicyliną).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Monosiarczan kanamycyny	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP906-5
LE agaroza	Genemat	3120-500	przez Fisher Scientific
Rosół z Lurii	Firma Difco	240230	przez Fisher Scientific
Elektroporator MicroPulser	Przedsiębiorstwo BioRad	1652100
Agar szlachetny, ultraczysty	Affymetris/USB	AAJ10907A1	przez Fisher Scientific
Sól fizjologiczna w proszku buforowana fosforanami	Sigma	P3813-10PAK	Sigma-Aldrich
Agar do izolacji Pseudomonas	Firma Difco	292710	przez Fisher Scientific
Rosół izolacyjny Pseudomonas	Alpha Biosciences	Zobacz materiał P16-115	Partia na zamówienie
Inkubator z wytrząsaniem	Naukowy Nowy Brunszwik	Innova 4080	Wstrząsanie przy 200 obr./min
Małe talerze (100 ø zewnętrzna x 10 mm)	Fisher Naukowy	FB0875713
Spektrofotometr SmartSpec Plus	Bio-Rad	170-2525	lub preferowana metoda/dostawca
Sacharoza	Fisher Naukowy	Zobacz materiał S5-500