Generowanie podwójnie krzyżowanych rekombinantów Pseudomonas aeruginosa w celu celowanej delecji genów

Streszczenie

Źródło: Valentine, M. E., et al. Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa i testowanie tłumienia wirulencji w prostym mysim modelu infekcji. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film pokazuje generowanie rekombinantów podwójnie krzyżowych w Pseudomonas aeruginosa przy użyciu strategii delecji genów opartej na plazmidzie. Proces ten polega na selekcji bakterii, które zawierają niereplikacyjny plazmid zintegrowany z genomem poprzez pojedyncze skrzyżowanie, a następnie wywołaniu drugiego zdarzenia rekombinacji pod selekcją sacharozy w celu wycięcia plazmidu. Udana rekombinacja podwójnej krzyżówki jest potwierdzona utratą oporności na antybiotyki i zdolności do wzrostu na pożywkach zawierających sacharozę.

Protokół

1. Wykrywanie podwójnie krzyżowanych rekombinantów P. aeruginosa

1. Dla każdej kultury bulionowej zaszczepij 10 μl kultury na wstępnie podgrzanej płytce PIA (Pseudomonas Isolation Agar) uzupełnionej 10% sacharozą (bez glicerolu) i smugą dla izolowanych kolonii. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Następnego dnia wyjmij płytki z inkubatora i sprawdź je pod kątem wzrostu. Kolonie odporne na sacharozę powinny być rekombinantami podwójnie krzyżowymi (tj. usunąć plazmid z chromosomu poprzez zdarzenie rekombinacji między innym homologicznym regionem wstawki plazmidu a chromosomem P. aeruginosa ).
   1. Nałóż co najmniej 20 kolonii sterylnymi wykałaczkami na wstępnie podgrzane płytki: 1) PIA, 2) PIA uzupełnione 10% sacharozą (bez glicerolu) i 3) PIA uzupełnione 300 μg/ml karbenicyliny.
3. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
4. Wyjmij płytki z inkubatora i zbadaj je pod kątem wzrostu. Prawdziwe rekombinanty podwójnie krzyżowe będą wrażliwe na karbenicylinę i odporne na sacharozę (tj. kolonie, które rosły na PIA i PIA uzupełnione sacharozą, ale nie rosły na PIA uzupełnione karbenicyliną).

Materiały