Przygotowanie i izolacja zarodników Streptomyces venezuelae z płynnej kultury

Streszczenie

Źródło: Schlimpert, S., et al. Fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe całego cyklu życiowego S. venezuelae przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje uprawę i izolację zarodników Streptomyces venezuelae. Zarodniki, uśpione komórki, które pomagają bakteriom przetrwać stres, są wytwarzane podczas ograniczania składników odżywczych i zbierane przez wirowanie. Metoda ta zapewnia czystą, przechowywaną w niskiej temperaturze zawiesinę zarodników do dalszych zastosowań.

Protokół

1. Izolacja świeżych zarodników Streptomyces venezuelae i przygotowanie zużytej pożywki hodowlanej

1. Zaszczepić 30 ml pożywki z ekstraktem drożdżowym i ekstraktem słodowym (MYM), uzupełnioną 60 μl roztworu pierwiastków śladowych R2 (TE), 10 μl zarodników szczepu SV60 [attBφBT1::p SS209 (PdivIVA-divIVA-mcherry PftsZ-ftsZ-ypet)]. W celu zapewnienia stałego wzrostu i zarodnikowania komórek należy użyć kolby z przegrodą lub kolby zawierającej sprężynę, aby umożliwić wystarczające napowietrzenie.
2. Komórki hodowlane przez 35-40 godzin w temperaturze 30 °C i 250 obr./min.
3. Zbadaj komórki za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym montowanej na cieczy. W tym momencie widoczne będą fragmenty grzybni i zarodniki.
4. Odwirować 1 ml komórek w wirówce stołowej o sile 400 x g przez 1 minutę w celu osadzenia grzybni i większych fragmentów komórek.
5. Przenieść około 300 μl supernatantu zawierającego zawiesinę zarodników do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać na lodzie. Zachowaj pozostałą pożywkę hodowlaną
6. Rozcieńczyć zarodniki w stosunku 1:20 w MYM-TE (końcowe stężenie: 0,5-5 x 10⁷ zarodników/ml) i trzymać na lodzie do momentu, gdy będą potrzebne.
   UWAGA: Chociaż dokładne warunki, które wywołują zarodnikowanie u Streptomyces , nie są zrozumiałe, użycie zużytej pożywki MYM-TE, w tym wszelkich nieznanych sygnałów zewnątrzkomórkowych z kultury zarodnikowej, stymuluje zarodnikowanie.
7. Przefiltrować i wysterylizować 10 ml pozostałej pożywki hodowlanej, aby uzyskać zużyty MYM-TE, który jest wolny od zarodników i fragmentów grzybni. Użyj sterylnego filtra strzykawkowego 0,22 μm i przenieś zużyty MYM-TE do sterylnej probówki o pojemności 15 ml.
8. Przygotowany zużyty MYM-TE należy przechowywać przez kilka dni w temperaturze 4 °C, jeżeli mają być przeprowadzone dodatkowe doświadczenia z zastosowaniem podobnych warunków wzrostu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ekstrakt słodowy z drożdży maltozowych (MYM)4 g Maltoza4 g Ekstrakt drożdżowy10 g Ekstrakt słodowyDodać 1 L H2O używając 50 % wody z kranu i 50 % wody z odwróconej osmozy i uzupełnić 200 ml roztworu pierwiastka śladowego R2 na 100 ml po autoklawowaniu			Pożywka zarodnikowa stosowana do hodowli Streptomyces venezuelae SV60
R2 Roztwór pierwiastków śladowych (TE)8 mg ZnCl240 mg FeCl 3-6H2O2 mg CuCl2-2H 2O2 mg MnCl2-4H 2O2 mg Na2B4O7-10H 2O2 mg (NH4)6Mo7O24-4H 2Oadd 200 ml H2OAutoklaw i przechowywać w temperaturze 4 °C			Dodaj 0,002 woluminów do MYM
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)	Sigma	P4417-100TAB	Służy do napełniania studni wlotowych nieużywanych torów w płytkach B04A w celu przygotowania płytki do krótkotrwałego przechowywania.
Filtry strzykawkowe 0,22 μm	Satorius stedim	16532-K	Przygotowanie zużytego MYM-TE