Fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe cyklu życiowego Streptomyces venezuelae

Streszczenie

Źródło: Schlimpert, S. i in. Fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe całego cyklu życiowego S. venezuelae przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film przedstawia fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe całego cyklu życia bakterii Streptomyces venezuelae przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego do wizualizacji kiełkowania, wzrostu strzępek i zarodnikowania w czasie rzeczywistym.

Protokół

1. Konfiguracja mikroskopu i protokołu poklatkowego

Nuta: Metodę tę zastosowano na w pełni zmotoryzowanym i zautomatyzowanym mikroskopie szerokokątnym z napędem silnikowym, wyposażonym w kamerę sCMOS, lampę metalohalogenkową, sprzętowy autofokus, uchwyt stolika na płytki 96-dołkowe oraz komorę środowiskową.

1. Wcześniej podgrzej komorę środowiskową do 30 °C, aby zapobiec problemom z autofokusem po rozpoczęciu eksperymentu. Wymagany czas zależy od zastosowanej komory środowiskowej, mikroskopu i systemu grzewczego. Rozpocznij podgrzewanie systemu w noc poprzedzającą eksperyment.
2. Włącz mikroskop i oprogramowanie do automatyzacji i sterowania mikroskopem. Aby uzyskać optymalne zbieranie sygnału i rozdzielczość przestrzenną, należy użyć obiektywu immersyjnego z olejkiem o dużej aperturze numerycznej (NA), takiego jak obiektyw DIC z olejem 100X, 1,46 NA. Wybierz odpowiednie filtry i lustra dichromatyczne, aby uzyskać obrazy różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) oraz obrazy fuzji białek żółto-fluorescencyjnych i czerwono-fluorescencyjnych.
3. Umieść kroplę olejku immersyjnego na obiektywie i dodaj płyn immersyjny na dno okienka obrazowania na płytce mikroprzepływowej, aby poprawić ostrość komórek podczas akwizycji obrazu. Ostrożnie zamontuj szczelne urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu odwróconego. Upewnij się, że płytka jest bezpiecznie umieszczona w stage uchwyt i nie przesuwa się w trakcie eksperymentu.
4. Ustaw ostrość w oknie obrazowania komory hodowli mikroprzepływowej, używając wbudowanych znaczników pozycji w celu orientacji. Skoncentruj się na skrajnej lewej części pierwszej komory przepływowej (oznaczonej "A") z pułapką o rozmiarze 5, odpowiadającą wysokości pułapki 0.7 μm.
5. W oprogramowaniu mikrofluidycznym załaduj ogniwa ze studzienki wlotowej 8 pod ciśnieniem 4 psi przez 15 sekund. Sprawdź gęstość komórek w komorze hodowlanej, przesuwając stolik po oknie obrazowania. Jeśli żadne zarodniki nie zostały uwięzione, powtórz etap ładowania komórek lub alternatywnie zwiększ ciśnienie ładowania i/lub czas ładowania do osiągnięcia pożądanej gęstości komórek (1-10 zarodników na okno obrazowania o wymiarach 2,048 x 2,048 pikseli). Unikaj przeciążania komory hodowlanej. Nuta: Zwykle używamy pułapki o rozmiarze 5 do obrazowania Streptomyces, ale uzyskaliśmy również dobre wyniki z pułapkami o rozmiarach 4 i 3.
6. Uruchom program przepływu w oprogramowaniu sterującym i pozwól płytce mikroprzepływowej na zrównoważenie cieplne przez 1 godzinę na etapie mikroskopu przed rozpoczęciem akwizycji obrazu.
7. W oprogramowaniu sterującym mikroskopem skonfiguruj wielowymiarową akwizycję, aby wykonać wiele obrazów w różnych pozycjach etapu w czasie:
   1. Dla Autozapisu: określ katalog, w którym mają być automatycznie zapisywane pliki obrazów.
   2. W przypadku ustawień oświetlenia określ wcześniej optymalne ustawienia oświetlenia dla każdej konkretnej konstrukcji. Do opisanego eksperymentu użyj następujących czasów ekspozycji: DIC 150 ms, YFP 250 ms, RFP 100 ms.
   3. W przypadku szeregów czasowych: Skonfiguruj szereg czasowy, aby uzyskać obrazy w żądanych punktach czasowych w sekwencji. Aby zobrazować cykl życiowy S. venezuelae, wybierz 40-minutowy przedział czasu w okresie 24 godzin.
   4. Dla pozycji stolika i autofokusa: zeskanuj komorę hodowlaną, przesuwając stolik i zapisz pozycje stolika dla każdej pozycji obrazowania, która Cię interesuje. Upewnij się, że pozycje jednostopniowe są wystarczająco oddalone od siebie, aby zminimalizować fotowybielanie i fototoksyczność. Zazwyczaj używa się do 12 pozycji. Uruchom procedurę autofokusa dla każdego punktu czasowego, aby skorygować powolny dryf ogniskowej. Jeśli jest to dostępne w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, ustaw strategię autofokusa na "lokalna aktualizacja powierzchni przez sprzętowy autofokus". Po zweryfikowaniu współrzędnych Z wybranych pozycji stolika aktywuj sprzętowy autofokus.
8. Rozpocznij eksperyment poklatkowy w oprogramowaniu sterującym mikroskopem.
9. Sprawdź, czy wszystkie pozycje stołu montażowego są nadal ostre w późniejszych punktach. W przypadku eksperymentów poklatkowych trwających kilka godzin od czasu do czasu obserwujemy dryf sceny nawet podczas korzystania z autofokusa. Jeśli pozycje stolika muszą zostać ponownie ustawione na ostrości, zatrzymaj eksperyment w odpowiednim punkcie czasowym, dostosuj ostrość i uruchom ponownie eksperyment w zdefiniowanym przedziale czasu obrazowania.
10. Przerwij akwizycję obrazu po 24-30 godzinach lub gdy strzępki w obszarze zainteresowania zróżnicują się w zarodniki. Następnie zatrzymaj program przepływu w oprogramowaniu i zdemontuj urządzenie mikroprzepływowe.
11. Przygotuj zużytą płytkę mikroprzepływową do krótkotrwałego przechowywania. Usunąć pozostałe media z dołka 1 do 6, opróżnić studzienkę na odpady 7 i studzienkę ładowania komórek 8. W sterylnych warunkach należy ponownie napełnić zużyte studzienki pasa "A" i studzienki nieużywanych pasów ("B" do "D") na płytce sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Uszczelnić płytkę parafilmem, aby zapobiec jej wysychaniu i przechowywać w temperaturze 4 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
B04A CellAsic ONIX płytka do komórek bakteryjnych	Merck-Millipore	Zobacz materiał B04A-03-5PK	Płytki do hodowli mikroprzepływowych
System perfuzji mikroprzepływowej CellAsic ONIX i ONIX FG (wersja 5.0.2)	Merck-Millipore	EV-262	Najnowszą wersję ONIX (lipiec 2015) oraz instrukcję korzystania z programu można znaleźć tutaj: http://www.merckmillipore.com
Mikroskop Axio Observer.Z1	Zeiss	431007-9902-000	W pełni zautomatyzowany i zmotoryzowany odwrócony mikroskop szerokokątny
Inkubator XL multi S1 z modułem temperatury S1 i grzałką XL S2	Zeiss	411857-9061-000	Komora środowiskowa otaczająca mikroskop
Obiektyw Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC	Zeiss	420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2	Hamamatsu Photonics K.K.	Zobacz materiał C11440-22CU
Oświetlacz HXP 120V	Zeiss	423013-9010-000
Zestaw filtrów FL 46 HE YFP bez przesuwu	Zeiss	489046-9901-000	Zestaw filtrów fluorescencyjnych, wzbudzenie 500/25 nm, emisja 535/30 nm
Zestaw filtrów FL 63 HE RFP bez przesuwu	Zeiss	489063-0000-000	Zestaw filtrów fluorescencyjnych, wzbudzenie 572/25 nm, emisja 629/30 nm
Ramka montażowa K-M do płytek wielodołkowych	Zeiss	000000-1272-644	Uchwyt stolika do płytki mikroprzepływowej
ZEN pro 2012	Zeiss	410135-1002-120	Oprogramowanie sterujące mikroskopem
Moduł ZEN Upływ czasu	Zeiss	410136-1031-110	Moduł oprogramowania do ustawiania eksperymentów z mikroskopią poklatkową
Kafelki/pozycje modułu ZEN	Zeiss	410136-1025-110	Moduł oprogramowania do zapisywania określonych pozycji scenicznych (xzy)
Fidżi	Pakiet oprogramowania typu open source	http://fiji.sc/Fiji	Generowanie filmów poklatkowych
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)	Sigma	P4417-100TAB	Służy do napełniania studni wlotowych nieużywanych torów w płytkach B04A w celu przygotowania płytki do krótkotrwałego przechowywania.
Zobacz materiał SV60	Kolekcja szczepów John Innes Centre		Szczep S. venezuelae wykazujący ekspresję divIVA-mcherry i ftsZ-ypet