Indukcja różnicowania Vibrio parahaemolyticus w komórki roju

Streszczenie

Źródło: Heering, J., et al. Indukcja różnicowania komórkowego i obrazowanie pojedynczych komórek Vibrio parahaemolyticus Swimmer i Swarmer cells. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film pokazuje indukcję różnicowania komórek roju u Vibrio parahaemolyticus przy użyciu specjalnie przygotowanego podłoża agarowego. Manipulując sygnałami środowiskowymi, takimi jak wyczerpanie żelaza, suplementacja wapnia i kontakt powierzchniowy, bakterie są stymulowane do przejścia z formy pływaka w wydłużone komórki roju z bocznymi wiciami. Te zróżnicowane komórki rozprzestrzeniają się po powierzchni ciała stałego, tworząc charakterystyczne rozbłyski roju, które oznaczają udaną zmianę morfologiczną.

Protokół

1. Indukcja różnicowania komórek roju

NUTA: Poniższe kroki opisują, jak indukować różnicowanie V. parahaemolyticus w cyklu życiowym komórki roju i jak stymulować proliferację na powierzchniach stałych.

1. Zawiesić 4 g agaru do infuzji serca (HI) w 100 ml ddH₂O w celu przygotowania płytek rojowych.

2. Ostrożnie zagotuj roztwór agaru HI w kuchence mikrofalowej i od czasu do czasu potrząsaj butelką, aż proszek się rozpuści. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 20 min.

3. Po autoklawowaniu schłodzić agar HI do temperatury 60-65 °C. Dodać 2,2'-Bipirydyl do końcowego stężenia 50 μM (roztwór podstawowy 50 mM w 100% etanolu). Dodać CaCl₂ do końcowego stężenia 4 mM (roztwór podstawowy 4 M w ddH₂O). W razie potrzeby dodaj antybiotyki do roztworu, aby utrzymać plazmidy.

NUTA: Jeśli planujesz użyć indukowalnego plazmidu, dodaj środek indukujący do jego końcowego stężenia.

UWAGA: 2,2'-Bipirydyl: Ostra toksyczność (doustna, skórna, wziewna). Podczas obchodzenia się z tą substancją chemiczną należy używać rękawic i okularów ochronnych.

4. Wlej 30 - 35 ml końcowego roztworu agaru HI do okrągłej płytki Petriego o średnicy 150 mm i pozwól agarowi zastygnąć.

5. Tuż przed wykryciem hodowli komórkowej suszyć płytkę agarową w temperaturze 37 °C przez co najmniej 10 minut (lub do momentu, gdy wszelkie pozostałości płynu znikną, ale nie dłużej) w pionie z otwartą pokrywką.
NUTA: Czas suszenia w dużym stopniu zależy od zastosowanego inkubatora, a mocno wysuszone płytki nie pozwolą na rojenie się V. parahaemolyticus. (Ten krok jest bardzo ważny!) Talerze muszą być świeże i nie powinny być starsze niż 2 - 3 godziny. Stare talerze będą zbyt suche, aby stymulować rojenie.

6. Zaszczepij niewielką ilość komórek z krawędzi pojedynczej kolonii do 5 ml bulionu Luria-Bertani (LB). Inkubować kulturę, wstrząsając w temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia OD₆₀₀ = 0,8, zwykle trwa to około 2-3 godzin. Następnie komórki są gotowe do nakrycia na płytkach agarowych roju HI.

7. Umieścić 1 μl kultury komórkowej w środku płytki roju agaru HI (ryc. 1A).

8. Pozostaw miejsce do wyschnięcia (Rysunek 1B).

9. Uszczelnij płytkę przezroczystą taśmą z tworzywa sztucznego i upewnij się, że jest dobrze przymocowana, w przeciwnym razie może się odczepić podczas nocnej inkubacji (Rysunek 1C).

NUTA: Bardzo ważne jest, aby uszczelka była idealna. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza i fałd na taśmie podczas jej nakładania.

10. Inkubować płytkę w temperaturze 24 °C przez noc. Spowoduje to powstanie kolonii roju V. parahaemolyticus z rozbłyskami roju rozciągającymi się od obrzeży kolonii roju (ryc. 2).

Wyniki

Rysunek 1: Indukcja różnicowania roju i przygotowanie komórek do obrazowania mikroskopowego. Uproszczona wizualizacja procesu produkcji komórek roju V. parahaemolyticus oraz przygotowanie preparatów mikroskopowych do ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komponenty multimedialne
LB średni	Roth	Zobacz materiał X968.3
Agar Difco, granulowany	BD	214510	Do przygotowania agaru LB z podłożem LB
Agar do naparu serca Difco	BD	244400	Do przygotowania płytek rojowych HI agar
Agaroza NEEO, ultra jakość	Roth	2267.3	Do przygotowania mikroskopowych padów agarozowych
Dodatków
2,2'-bipirydyl	Sigma Aldrich	D216305-25G	Do przygotowania płytek rojowych HI agar
Chlorek wapnia dwuwodny	Roth	5239.1	Do przygotowania płytek rojowych HI agar
Sprzęt
szalka Petriego 150 mm x 20 mm z krzywkami	Sarstedt powiedział:	82.1184.500	Do przygotowania płytek rojowych HI agar
kelvitron T (B 6420)	Heraeus (Heraeus)	-	Służy do suszenia płytek rojowych HI agar