Monitorowanie infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych

Streszczenie

Źródło: Lee, H. i wsp., Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film przedstawia metodę monitorowania infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych za pomocą komplementacji dzielonego białka fluorescencyjnego (sfGFP) w połączeniu z mikroskopią konfokalną. Podejście to umożliwia precyzyjną wizualizację translokacji efektorowej do cytozolu komórki gospodarza.

Protokół

NUTA: Wszystkie czynności są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Przygotowanie materiału roślinnego (4 tygodnie)

1. Przygotowanie dla roślin Nicotiana benthamiana
   1. Zasiej 2 nasiona N. benthamiana na powierzchni gleby każdej doniczki, przykryj tacę plastikową kopułą i pozwól nasionom wykiełkować w komorze wzrostowej o temperaturze 25 °C i wilgotności 60% z 16/8-godzinnym cyklem fotoperiodu jasnego/ciemnego.
   2. Po dwóch tygodniach wybierz i wyrzuć najmniejszą sadzonkę z każdej doniczki. Kontynuuj uprawę roślin w tych samych warunkach wzrostu, jakie zastosowano do kiełkowania w kroku 1.1.1. Dodawaj 1 l wody na tacę co dwa dni.
      NUTA: Warunki wzrostu roślin mogą się różnić w zależności od laboratorium. Dlatego postępuj zgodnie z regularnym protokołem podlewania, aby wyhodować roślinę w zdrowym stanie.
   3. W ciągu tygodnia przenieś rośliny na nową tacę i ułóż je z odpowiednią przestrzenią do dalszego wzrostu. Kontynuuj uprawę roślin w warunkach opisanych w kroku 1.1.1, aż będą gotowe do infiltracji w wieku 4 tygodni.
      NUTA: Wzrost roślin może się różnić w zależności od warunków wzrostu w różnych laboratoriach. Zwykle okazuje się, że 4-tygodniowe rośliny N. benthamiana mają około sześciu liści.
2. Preparat dla roślin transgenicznych Arabidopsis thaliana
   1. Zapoznaj się z Tabelą Materiałów i zamów transgeniczne nasiona Arabidopsis .
   2. Namocz ~ 50 - 100 transgenicznych nasion Arabidopsis w 1 ml wody destylowanej i przechowuj je w temperaturze 4 °C przez 3 dni w ciemności, aby zsynchronizować początek kiełkowania.
   3. Zasiej ~ 2 - 3 nasiona na powierzchni gleby tacki na rośliny i przykryj tacę plastikową kopułą. Pozwól nasionom wykiełkować w temperaturze 23 °C, wilgotności 60% w 10/14-godzinnym cyklu fotoperiodycznym jasnym/ciemnym.
      NUTA: Nasiona powinny być homozygotyczne. Zalecamy jednak ponowne potwierdzenie obecności transgenu w partii. W takim przypadku wysterylizuj nasiona, myjąc 70% etanolem przez 2 min, 50% wybielaczem (około 2% podchlorynem) zawierającym 0,05% Triton X-100 przez 5 minut. Następnie umyć 5 - 6 razy sterylną wodą podwójnie destylowaną (ddH₂O). Po sterylizacji rozwarstwić je w temperaturze 4 °C przez 3 dni i umieścić na pożywce do kiełkowania roślin zawierającej 25 μg/l higromycyny B w celu wyselekcjonowania roślin transgenicznych.
   4. Po tygodniu pozostaw tylko jedną roślinę na korek i kontynuuj uprawę roślin w tych samych warunkach wzrostu, które zastosowano w kroku 1.2.3.
      NUTA: Czterotygodniowe rośliny wykorzystano do zakażenia Pseudomonas syringae . Podlewaj rośliny co drugi dzień, aby utrzymać rośliny w zdrowiu.

2. Przygotowanie hodowli Pseudomonas (~1 tydzień)

1. Budowa plazmidu do transformacji Pseudomonas
   1. Zapoznaj się z Tabelą materiałów i zamów żądany wektor (wektory) wektora systemu dostarczania efektorów opartego na systemie wydzielania typu III (T3SS).
   2. Wstawić interesujący gen efektorowy do wektora dostarczania efektora za pomocą klonowania rekombinacji specyficznej dla miejsca.
      NUTA: Monitorując subkomórkową lokalizację białka efektorowego o pełnej długości, należy umieścić gen o pełnej długości w pBK-GW-1-2 lub pBG-GW-1-2. Możliwe jest również wybranie pBK-GW-1-4 lub pBG-GW-1-4 zawierających 2x sfGFP11 (11. nić β sfGFP) w celu zwiększenia sygnału fluorescencji. W przypadku efektora częściowego pozbawionego peptydu sygnałowego należy zastosować pBK-GW-2-2 lub pBK-GW-2-4.
2. Przekształć plazmid przenoszący efektor połączony ze znacznikiem sfGFP11 w P. syringae pv. Pomidor (Pst) CUCPB5500 przy użyciu standardowej elektroporacji.
   NUTA: W razie potrzeby można użyć innych szczepów Pseudomonas . System znaczników sfGFP11 jest skonstruowany dla szerokiej gamy wektorów, a ekspresja genu efektora jest regulowana przez promotor AvrRpm1, który jest porównywalny np . z Pseudomonas fluorescens (EthAn).
3. Delikatnie rozprowadzić przekształcone komórki bakteryjne na powierzchni płytek agarowych King's B zawierających 100 μg/ml ryfampicyny i 25 μg/ml kanamycyny lub 25 μg/ml gentamycyny. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 2 dni.
4. Zaszczepić jedną kolonię w płynnej pożywce King's B antybiotykami odpowiednimi dla użytego wektora i hodować komórki przez noc w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
5. Zrób bulion glicerolowy. Dodać autoklawizowany glicerol do końcowego stężenia 50% i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Przejściowa ekspresja sfGFP1-10^OPT ukierunkowanego na organelle (1-10^th β-nić sfGFP) u N. benthamiana (4 dni)

1. Przygotowanie kultury Agrobacterium
   1. Zamów żądany wektor(y) plazmidu (sfGFP1-10)^OPT ukierunkowanego na organelle (patrz Tabela materiałów).
   2. Przekształć plazmid (plazmidy) w komórki szczepu Agrobacterium tumefaciens GV3101. Hodować komórki na podłożu agarowym Luria-Bertani (LB) uzupełnionym 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny w temperaturze 28 °C przez 2 dni.
   3. Z pojedynczej kolonii na pożywce agarowej LB zaszczepić komórki w 5 ml płynnej pożywki LB uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny. Hodować komórki przez noc w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
   4. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3 000 x g przez 10 minut. Odlać pożywkę sklarowaną nad osadem i ponownie zawiesić osad w 1 ml świeżo przygotowanego buforu infiltracyjnego.
   5. Zmierzyć ilość Agrobacterium , uzyskując wartość gęstości optycznej (OD) przy absorbancji 600 nm (Abs 600 nm). Dostosuj OD₆₀₀ bakterii do 0,5 z buforem infiltracyjnym.
      UWAGA: 1 ml zawiesiny wystarcza do infiltracji w dwóch miejscach.
   6. Pozostaw kulturę w temperaturze pokojowej na delikatnym bujaku na 1 - 5 godzin przed infiltracją.
   7. Zrób otwór w środku liści, który ma być infiltrowany za pomocą końcówki o pojemności 10 μl. Użyj 1-mililitrowej strzykawki bezigłowej, aby naciekać zawiesiny Agrobacterium . Ostrożnie i powoli wstrzyknąć około 500 μl zawiesin przygotowanych w kroku 3.1.5 w stronę przyosiową liścia za pomocą strzykawki. Powtórzyć infiltrację na co najmniej trzech różnych roślinach w celu uzyskania powtórzeń eksperymentalnych.
      NUTA: Ze względów zdrowotnych i bezpieczeństwa podczas infiltracji należy nosić okulary ochronne.
   8. Zetrzyj pozostałą zawiesinę bakteryjną na liściach i zaznacz granicę naciekanego obszaru.
   9. Utrzymuj naciekane rośliny w tych samych warunkach wzrostu, co w kroku 1.1.1 przez 2 dni.

4. Inokulacja Pseudomonas (4 dni)

1. Przekształcony szczep Pseudomonas z glicerolu w kroku 2.5 należy przetworzyć na pożywce agarowej King's B odpowiednimi antybiotykami w temperaturze 28 °C przez 2 dni.
   NUTA: Zdrowie Pseudomonas jest bardzo krytyczne. Jeśli kolonie nie tworzą się dobrze, przed kontynuowaniem ponownie przełóż komórki lub rozmnoż je w płynnym pożywce króla.
2. Zaszczepić pętlę komórek Pseudomonas w płynnym podłożu z glutaminianu mannitolu (MG) w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez noc.
3. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3 000 x g przez 10 minut. Odlać pożywkę sklarowaną nad osadem, ponownie zawiesić osad w 10 mM MgCl₂ i dostosować OD₆₀₀ do 0,02 (1 x 10⁷ jtk/ml) dla liści N. benthamiana i do 0,002 (1 x 10⁶ jtk/ml) dla liści Arabidopsis.
4. W przypadku N. benthamiana zawiesinę Pseudomonas należy naciekać w obszar liści, w którym 2 dni wcześniej infiltrowany był konstrukt Agrobacterium przenoszący sfGFP1-10^OPT (jak w kroku 3.1.7). W przypadku transgenicznego rzodkiewnika sfGFP1-10^OPT należy naciekać zawiesinę Pseudomonas do dwóch 4-tygodniowych, krótkich, jednodniowych liści.
   NUTA: Do przeprowadzenia prób eksperymentalnych potrzebne są co najmniej trzy rośliny.

5. Obserwacja sygnału sfGFP za pomocą mikroskopii konfokalnej (1 dzień)

1. Wytnij krążek liściowy z liści zaszczepionych przez Pseudomonas. W określonych punktach czasowych po infiltracji Pseudomonas, zobrazuj dwa^{2-centymetrowe} dyski liściowe z pojedynczej rośliny za pomocą konfokalnego systemu skanowania laserowego z obiektywem C-Apochromat do zanurzenia w wodzie 40X/1,2 z aperturą numeryczną (NA) lub obiektywem zanurzeniowym C-Apochromat 63X/0,8 NA. Aby uniknąć śmierci martwych komórek w wyniku zranienia, obserwuj komórki z dala od otworu infiltracyjnego.
2. Rozpocznij obserwację przy niskim ustawieniu mocy lasera argonowego 488 nm. Zwiększ moc lasera, aby wykryć sfGFP.
   NUTA: Do wykrycia sygnału fluorescencji używamy zwykle 2 - 15% intensywności lasera. Jednak moc lasera i ustawienia wykrywania należy dostosować w oparciu o system mikroskopowy użytkownika. Tutaj filtry emisji zostały ustawione na 520 - 550 nm. Martwe komórki często emitują autofluorescencję pod wpływem wzbudzenia laserowego o długości fali 488 nm. Dlatego, jako kontrola ujemna, ten sam efektor bez znacznika sfGFP11 powinien być infiltrowany i obserwowany w tych samych warunkach obserwacji. Ponadto wysokie wzbudzenie lasera może indukować autofluorescencję chlorofilu. Dlatego dostosuj intensywność lasera za pomocą kontrolnych komórek roślinnych, aby nie indukować autofluorescencji chlorofilu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Linie transgeniczne Arabidopsis			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Czasoprzestrzenne monitorowanie efektorów Pseudomonas syringae poprzez wydzielanie typu III przy użyciu podzielonych fluorescencyjnych fragmentów białka. Komórka roślinna. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	Certyfikat ABRC	CS69831
NU-sfGFP1-10	Certyfikat ABRC	CS69832
Zobacz materiał PT-sfGFP1-10	Certyfikat ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	Certyfikat ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	Certyfikat ABRC	CS69835
ER-sfGFP1-10	Certyfikat ABRC	CS69836
GO-sfGFP1-10	Certyfikat ABRC	CS69837
PM-sfGFP1-10	Certyfikat ABRC	CS69838
Plazmid sfGFP1-10OPT ukierunkowany na organelle			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Czasoprzestrzenne monitorowanie efektorów Pseudomonas syringae poprzez wydzielanie typu III przy użyciu podzielonych fluorescencyjnych fragmentów białka. Komórka roślinna. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	Addgene powiedział:	97387
NU-sfGFP1-10	Addgene powiedział:	97388
Zobacz materiał PT-sfGFP1-10	Addgene powiedział:	97389
MT-sfGFP1-10	Addgene powiedział:	97390
PX-sfGFP1-10	Addgene powiedział:	97391
ER-sfGFP1-10	Addgene powiedział:	97392
GO-sfGFP1-10	Addgene powiedział:	97393
PM-sfGFP1-10	Addgene powiedział:	97394
ER-sfWiśnia1-10	Addgene powiedział:	97403
ER-sfYFP1-10	Addgene powiedział:	97404
CYTO-sfCFP1-10	Addgene powiedział:	97405
Wektor kompatybilny z bramką oznaczoną sfGFP11 dla systemu dostarczania efektorów opartego na T3SS	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Czasoprzestrzenne monitorowanie efektorów Pseudomonas syringae poprzez wydzielanie typu III przy użyciu podzielonych fluorescencyjnych fragmentów białka. Komórka roślinna. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene powiedział:	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Kanamycynę (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4	Addgene powiedział:	98251	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Kanamycynę (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2	Addgene powiedział:	98252	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Kanamycynę (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4	Addgene powiedział:	98253	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Kanamycynę (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2	Addgene powiedział:	98254	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na gentamycynę (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4	Addgene powiedział:	98255	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na gentamycynę (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2	Addgene powiedział:	98256	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na gentamycynę (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4	Addgene powiedział:	98257	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na gentamycynę (25 ug/ml)
Szczepy bakteryjne
Agrobacterium tumefaciens GV3101			Csaba Koncz i Jeff Schell, Promotor genu 5 TL-DNA kontroluje specyficzną tkankowo ekspresję genów chimerycznych przenoszonych przez nowy typ wektora binarnego Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Odporny na gentamycynę (50 ug/ml) i ryfampicynę (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Pomidorowy CUCPB5500			Kvitko, B. H. i wsp. Delecje w repertuarze Pseudomonas syringae pv. Geny efektorowe wydzielania pomidora DC3000 typu III ujawniają funkcjonalne nakładanie się efektorów. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Odporny na ryfampicynę (100 ug/ml)
Komponenty multimedialne
Pożywki do kiełkowania roślin			Dodaj 2,165 g/l proszku Murashige & Skoog, 10 g/l sacharozy do wody. Dostosuj do pH 5,8 i dodaj 2,2 g/l fitagelu. Automatyczne cielenie.
Murashige & Skoog medium zawierające witaminy	Duchefa Biochemie	Zobacz materiał M0222 TGL	Przechowywać w temperaturze 4 °C.
Sacharoza	Duchefa Biochemie	S0809 powiedział:
Fitagel	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P8169
Nośniki LB			Do wody dodać 10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 10 g/l NaCl. W przypadku pożywek stałych dodać 15 g/l mikro agaru. Autoklaw. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury 55 °C i w razie potrzeby dodać antybiotyk.
Trypton	BD Bioscience	211705
Ekstrakt drożdżowy	BD Bioscience	212750
Zawartość NaCl	Duchefa Biochemie	Zobacz materiał S0520
Mikro agar	Duchefa Biochemie	Zobacz materiał M1002
Głośniki King's B			10 g/L proteazy pepton #2, 1,5 g/L bezwodny K2HPO4, 15 g/L agaru do wody. Autoklaw. Schłodzić do temperatury 55 °C i dodać do podłoża sterylne 15 ml/l glicerolu, 5 ml/lMgSO4 . W razie potrzeby dodaj antybiotyki.
Pepton proteozy	BD Bioscience	212120
Bezwodny K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128 USP
Glicerol	Duchefa Biochemie	Zobacz materiał G1345
MgSO4	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M7506
Bacto Agar	BD Bioscience	214010
Płynne media z glutaminianem mannitolu (MG)			Do wody dodać 10 g/l mannitolu, 2 g/l kwasu L-glutaminowego, 0,5 g/l KH2PO4, 0,2 g/l NaCl i 0,2 g/lMgSO4 . Dostosuj do pH 7
Mannitol	Duchefa Biochemie	Zobacz materiał M0803 TGL
Kwas L-glutaminowy	Duchefa Biochemie	G0707 powiedział:
KH2PO4	Sigma-Aldrich	NIST200B
Bufor infiltracji			10 mM MES (kwas 2-(N-morfolino)-etanosulfonowy), 10 mM MgCl2, 150 μM acetosyringon. pH 5,6; Przed użyciem przygotuj świeży bufor.
MES	Duchefa Biochemie	Zobacz materiał M1503	Przygotuj 100 mM (pH 5,6) wywaru w wodzie. Filtruj sterylizację.
MgCl2	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M8266	Przygotuj 100 mM zapasu w wodzie. Autoklaw.
Acetosyringon	Sigma-Aldrich	D134406	Przygotuj zapas 150 mM w DMSO.
Sprzęt/materiały do mikroskopu konfokalnego
Laserowy skaningowy system konfokalny 710	Carl Zeiss
Mikroskop odwrócony Axio observer Z1	Carl Zeiss