Ten film przedstawia metodę monitorowania infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych za pomocą komplementacji dzielonego białka fluorescencyjnego (sfGFP) w połączeniu z mikroskopią konfokalną. Podejście to umożliwia precyzyjną wizualizację translokacji efektorowej do cytozolu komórki gospodarza.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Monitorowanie infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych
593 wyświetleń
⸱
26 września 2025
W tym artykule
Streszczenie
Protokół
NUTA: Wszystkie czynności są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
1. Przygotowanie materiału roślinnego (4 tygodnie)
- Przygotowanie dla roślin Nicotiana benthamiana
- Zasiej 2 nasiona N. benthamiana na powierzchni gleby każdej doniczki, przykryj tacę plastikową kopułą i pozwól nasionom wykiełkować w komorze wzrostowej o temperaturze 25 °C i wilgotności 60% z 16/8-godzinnym cyklem fotoperiodu jasnego/ciemnego.
- Po dwóch tygodniach wybierz i wyrzuć najmniejszą sadzonkę z każdej doniczki. Kontynuuj uprawę roślin w tych samych warunkach wzrostu, jakie zasto....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Linie transgeniczne Arabidopsis | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Czasoprzestrzenne monitorowanie efektorów Pseudomonas syringae poprzez wydzielanie typu III przy użyciu podzielonych fluorescencyjnych fragmentów białka. Komórka roślinna. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Certyfikat ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | Certyfikat ABRC | CS69832 | |
| Zobacz materiał PT-sfGFP1-10 | Certyfikat ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | Certyfikat ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | Certyfikat ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | Certyfikat ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | Certyfikat ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | Certyfikat ABRC | CS69838 | |
| Plazmid sfGFP1-10OPT ukierunkowany na organelle | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Czasoprzestrzenne monitorowanie efektorów Pseudomonas syringae poprzez wydzielanie typu III przy użyciu podzielonych fluorescencyjnych fragmentów białka. Komórka roślinna. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Addgene powiedział: | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene powiedział: | 97388 | |
| Zobacz materiał PT-sfGFP1-10 | Addgene powiedział: | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene powiedział: | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene powiedział: | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene powiedział: | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene powiedział: | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene powiedział: | 97394 | |
| ER-sfWiśnia1-10 | Addgene powiedział: | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene powiedział: | 97404 | |
| CYTO-sfCFP1-10 | Addgene powiedział: | 97405 | |
| Wektor kompatybilny z bramką oznaczoną sfGFP11 dla systemu dostarczania efektorów opartego na T3SS | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Czasoprzestrzenne monitorowanie efektorów Pseudomonas syringae poprzez wydzielanie typu III przy użyciu podzielonych fluorescencyjnych fragmentów białka. Komórka roślinna. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene powiedział: | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Kanamycynę (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene powiedział: | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Kanamycynę (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene powiedział: | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Kanamycynę (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene powiedział: | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na Kanamycynę (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene powiedział: | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na gentamycynę (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene powiedział: | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na gentamycynę (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene powiedział: | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na gentamycynę (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene powiedział: | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Odporny na gentamycynę (25 ug/ml) |
| Szczepy bakteryjne | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz i Jeff Schell, Promotor genu 5 TL-DNA kontroluje specyficzną tkankowo ekspresję genów chimerycznych przenoszonych przez nowy typ wektora binarnego Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Odporny na gentamycynę (50 ug/ml) i ryfampicynę (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Pomidorowy CUCPB5500 | Kvitko, B. H. i wsp. Delecje w repertuarze Pseudomonas syringae pv. Geny efektorowe wydzielania pomidora DC3000 typu III ujawniają funkcjonalne nakładanie się efektorów. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Odporny na ryfampicynę (100 ug/ml) | ||
| Komponenty multimedialne | |||
| Pożywki do kiełkowania roślin | Dodaj 2,165 g/l proszku Murashige & Skoog, 10 g/l sacharozy do wody. Dostosuj do pH 5,8 i dodaj 2,2 g/l fitagelu. Automatyczne cielenie. | ||
| Murashige & Skoog medium zawierające witaminy | Duchefa Biochemie | Zobacz materiał M0222 TGL | Przechowywać w temperaturze 4 °C. |
| Sacharoza | Duchefa Biochemie | S0809 powiedział: | |
| Fitagel | Sigma-Aldrich | Zobacz materiał P8169 | |
| Nośniki LB | Do wody dodać 10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 10 g/l NaCl. W przypadku pożywek stałych dodać 15 g/l mikro agaru. Autoklaw. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury 55 °C i w razie potrzeby dodać antybiotyk. | ||
| Trypton | BD Bioscience | 211705 | |
| Ekstrakt drożdżowy | BD Bioscience | 212750 | |
| Zawartość NaCl | Duchefa Biochemie | Zobacz materiał S0520 | |
| Mikro agar | Duchefa Biochemie | Zobacz materiał M1002 | |
| Głośniki King's B | 10 g/L proteazy pepton #2, 1,5 g/L bezwodny K2HPO4, 15 g/L agaru do wody. Autoklaw. Schłodzić do temperatury 55 °C i dodać do podłoża sterylne 15 ml/l glicerolu, 5 ml/lMgSO4 . W razie potrzeby dodaj antybiotyki. | ||
| Pepton proteozy | BD Bioscience | 212120 | |
| Bezwodny K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
| Glicerol | Duchefa Biochemie | Zobacz materiał G1345 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | Zobacz materiał M7506 | |
| Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
| Płynne media z glutaminianem mannitolu (MG) | Do wody dodać 10 g/l mannitolu, 2 g/l kwasu L-glutaminowego, 0,5 g/l KH2PO4, 0,2 g/l NaCl i 0,2 g/lMgSO4 . Dostosuj do pH 7 | ||
| Mannitol | Duchefa Biochemie | Zobacz materiał M0803 TGL | |
| Kwas L-glutaminowy | Duchefa Biochemie | G0707 powiedział: | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Bufor infiltracji | 10 mM MES (kwas 2-(N-morfolino)-etanosulfonowy), 10 mM MgCl2, 150 μM acetosyringon. pH 5,6; Przed użyciem przygotuj świeży bufor. | ||
| MES | Duchefa Biochemie | Zobacz materiał M1503 | Przygotuj 100 mM (pH 5,6) wywaru w wodzie. Filtruj sterylizację. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | Zobacz materiał M8266 | Przygotuj 100 mM zapasu w wodzie. Autoklaw. |
| Acetosyringon | Sigma-Aldrich | D134406 | Przygotuj zapas 150 mM w DMSO. |
| Sprzęt/materiały do mikroskopu konfokalnego | |||
| Laserowy skaningowy system konfokalny 710 | Carl Zeiss | ||
| Mikroskop odwrócony Axio observer Z1 | Carl Zeiss |
