Ukierunkowana izolacja kolonii bakteryjnych za pomocą degradacji hydrożelu o jasnym wzorze

Abstract

Źródło: Fattahi, N., et al. Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film pokazuje ekstrakcję kolonii bakteryjnych z fotodegradowalnego hydrożelu za pomocą światła UV. Wybierana jest określona kolonia, a wzorzysta ekspozycja na światło ma na celu zainicjowanie miejscowej degradacji hydrożelu. Po dostosowaniu natężenia i czasu trwania światła stosuje się światło UV, uwalniając kolonię. Kolonia jest następnie zasysana przez rurki i przenoszona do rurki w celu dalszej analizy.

Protocol

1. Szczepy bakteryjne i protokoły hodowli

1. Smugi kolonii bakterii na płytkach agarowych uzupełnione odpowiednimi pożywkami wzrostowymi. W tym raporcie B. subtilis (szczep 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) jest hodowany na ATGN (0,079 M KH₂PO₄ (diwodorofosforan potasu), 0,015 M (NH₄)₂SO₄ (siarczan amonu), 0,6 mM MgSO₄·_7H2O (siedmiowodny siarczan magnezu), 0,06 mM CaCl₂·2H₂O (dwuwodny chlorek wapnia), 0,0071 mM_{MnSO 4}·H₂O (jednowodny siarczan manganu(II)), 0,125 M FeSO₄·7H₂O (siedmiowodny siarczan żelaza), 28 mM glukozy, pH: 7 ± 0,2, 15 g/L agar) z dodatkiem 100 μg/ml spektynomycyny i E. coli (szczep 25922, ATCC) na płytkach agarowych ATGN uzupełnionych 100 μg/ml ampicyliny.
   UWAGA: Wcześniejsze doniesienia o kapsułkowaniu i uwalnianiu hydrożelu za pomocą tych materiałów wykorzystywały komórki C58 A. tumefaciens
2. Wybierz żądane kolonie z płytek agarowych ATGN i rozpocznij hodowle przez noc. W przypadku stosowanych tu szczepów E. coli i B. subtilis należy przeprowadzić hodowlę w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 215 obr./min w płynnym podłożu ATGN przez 24 godziny. Przechowuj kultury komórkowe w 50% glicerolu w temperaturze -80 °C do przyszłego użycia.
3. Pobrać kolonie obu szczepów z zapasów glicerolu za pomocą sterylnych pętli inokulacyjnych i inkubować w płynnych pożywkach ATGN przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 215 obr./min.

2. Przygotowanie materiału potrzebnego do tworzenia hydrożelu

1. Fotodegradowalny PEG-o-NB-diakrylan (poli(glikol etylenowy)-orto-nitrobenzyl-diakrylan) synteza
   UWAGA: Wewnętrzna synteza dikrylanu PEG-o-NB została dobrze opisana i wcześniej opisana. Alternatywnie, ponieważ synteza jest rutynowa, można ją zlecić na zewnątrz z zakładu syntezy chemicznej.
2. Bufor sieciujący
   1. Weź przepis na wybraną pożywkę dla szczepu bakteryjnego i przygotuj pożywkę z 2x składnikami odżywczymi. Dodać fosforan, np. NaH₂PO₄ (diwodorofosforan sodu), do pożywki do końcowego stężenia 100 mM. Następnie dostosuj wartość pH do 8 za pomocą 5 M NaOH (wodorotlenek sodu) (wodny).
   2. Wysterylizować roztwór buforowy i przechowywać go w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: Pomiń wszelkie metale przejściowe obecne w mediach, ponieważ metale te katalizują utlenianie tioli do dwusiarczków.
3. Roztwór diakrylanu PEG-o-NB
   1. Na każdy mg podwielokrotnego diakrylanu PEG-o-NB (masa cząsteczkowa 3 400 Da) dodać 3,08 μl ultraczystej wody, aby osiągnąć stężenie 49 mM diakrylanu PEG-o-NB (stężenie akrylanu 98 mM).
   2. Zmieszać roztwór, aż będzie dobrze wymieszany i przechowywać ten roztwór w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
4. 4-ramienny roztwór PEG-tiol
   1. W przypadku 4-ramiennego preparatu PEG-tiol (10 000 Da o masie cząsteczkowej) dodać 4 μl ultraczystej wody na mg proszku, aby osiągnąć stężenie 20 mM (80 mM stężenia tiolu).
   2. Mieszać ten roztwór aż do jego dobrego wymieszania i przechowywać go w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.

3. Przygotowanie perfluoroalkilowanych (niereaktywnych) szkiełek nakrywkowych

1. Umieść do 5 szkiełek podstawowych (25 mm x 75 mm x 1 mm) w koperty na slajdy z polipropylenu. Sonikować szkiełka 2% (w/v) roztworem detergentu (tabela materiałów) przez 20 minut.
2. Opłucz szkiełka trzykrotnie ultraczystą wodą, a następnie poddaj je sonikacji w wodzie przez 20 minut. Wysuszyć szkiełka przy użyciu strumienia N₂ (azotu).
3. Czyścić plazmowo (patrz Tabela Materiałów) po obu stronach szkiełek podstawowych zgodnie z protokołem w punkcie 4.1 przez 2 min.
4. Umieść oczyszczone plazmowo szkiełka z powrotem w komorze do szkiełek i napełnij pojemnik 0,5% (v/v) roztworem trichloro(1H, 1H, 2H, 2H,-perfluorooktylo)silanu w toluenie. Pozwól tym szklanym szkiełkom funkcjonować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
5. Po funkcjonalizacji szkiełek należy je przepłukać w komorze do szkiełek, najpierw toluenem, a następnie etanolem (trzy razy każdym rozpuszczalnikiem). Następnie wysusz każde funkcjonalizowane szkiełko strumieniem N₂.

4. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych (bazowych) funkcjonalizowanych tiolem

1. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych za pomocą myjki plazmowej
   1. Umieścić szkiełka nakrywkowe o wymiarach 18 mm x 18 mm na szalce Petriego. Następnie umieść szalkę Petriego w komorze myjki plazmowej i włącz zasilanie myjki plazmowej.
   2. Włącz pompę próżniową, aby oczyścić powietrze w komorze, aż manometr wskaże 400 mTorr.
   3. Otwórz zawór dozujący, aby wpuścić powietrze do komory, aż manometr osiągnie stałe ciśnienie (800-1000 mTorr). Następnie wybierz RF z trybem "Hi" i naświetl szkiełka nakrywkowe na 3 minuty.
   4. Po 3 minutach wyłącz tryb RF i pompę próżniową.
   5. Wyjmij szalkę Petriego z komory, odwróć szkiełka nakrywkowe, umieść je z powrotem w komorze na plazmę i odsłoń drugą stronę szklanego szkiełka nakrywkowego.
   6. Powtórzyć kroki 4.1.2-4.1.4, aby oczyścić nieobrobioną stronę szkiełka nakrywkowego plazmą.
   7. Po zakończeniu procesu należy wyjąć szalkę Petriego z komory i wyłączyć myjkę plazmową oraz pompę próżniową.
2. Czyszczenie i hydroksylacja szkiełek nakrywkowych roztworem piranii
   UWAGA: Do czyszczenia i hydroksylowania szkiełek szklanych można stosować standardowe protokoły czyszczenia piranii. Roztwór piranii jest mieszaniną H₂O₂ (nadtlenek wodoru) i H₂SO₄ (kwas siarkowy) w proporcji 30:70 (v/v). Można również stosować alternatywne metody czyszczenia szkiełek nakrywkowych.
   UWAGA: Roztwór piranii jest silnie i wybuchowy z rozpuszczalnikami organicznymi i należy obchodzić się z nim z najwyższą ostrożnością. Należy wdrożyć odpowiednie środki bezpieczeństwa i ograniczające rozprzestrzenianie się wirusa, takie jak stosowanie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, fartuch chemiczny, okulary ochronne, osłona twarzy, rękawice butylowe kwasoodporne). Wszystkie naczynia szklane i powierzchnie robocze mające kontakt z roztworem piranii powinny być czyste, suche i wolne od pozostałości organicznych przed użyciem. Roztwór piranii nigdy nie powinien być przechowywany w częściowo zamkniętym lub zamkniętym pojemniku.
   1. Umieść czyste szklane naczynie o wymiarach 100 mm x 50 mm na mieszadle magnetycznym z płytą grzejną z regulowaną prędkością mieszania pod wyciągiem i dodaj do naczynia 14 ml_H2SO4.
   2. Delikatnie umieść małe, pokryte teflonem mieszadło magnetyczne za pomocą kleszczyków pokrytych teflonem wewnątrz naczynia. Następnie powoli obracaj mieszadłem, aby uniknąć rozpryskiwania kwasu.
   3. Następnie delikatnie dodaj 6 ml_H2O2do naczynia i pozwól, aby roztwór dobrze się wymieszał.
   4. Wyłącz mieszadło, a następnie wyjmij mieszadło z naczynia za pomocą kleszczy. Następnie delikatnie umieść szkiełka nakrywkowe w naczyniu za pomocą kleszczyków i ustaw temperaturę na 60–80 °C.
   5. Po 30 minutach delikatnie usuń szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszczyków i zanurz je dwukrotnie w wodzie dejonizowanej (DI), aby zmyć resztki roztworu piranii.
   6. Po spłukaniu wodą szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w wodzie DI o temperaturze suchej do dalszego użycia.
   7. Wyłącz płytę grzejną i pozwól roztworowi piranii ostygnąć.
   8. Aby usunąć roztwór piranii, delikatnie umieścić szklane naczynie o wymiarach 100 mm x 50 mm zawierające schłodzony roztwór piranii w większej, pustej szklanej zlewce o objętości co najmniej 1,5 l. Następnie dodaj 1 l wody do rozcieńczenia i dodaj wodorowęglan sodu w proszku w celu zneutralizowania. Należy pamiętać, że wodorowęglan sodu spowoduje bulgotanie i wytwarzanie ciepła i powinien być dodawany bardzo powoli; W przeciwnym razie bulgotanie może prowadzić do rozpryskiwania się kwasu. Gdy dalsze dodawanie wodorowęglanu sodu nie powoduje bulgotania, należy sprawdzić pH za pomocą papieru pH, aby upewnić się, że zostało zneutralizowane. Po zneutralizowaniu i schłodzeniu roztworu można go wylać do zlewu.
3. Funkcjonalizacja tiolowa szkiełek nakrywkowych
   1. Przygotować 5% (v/v) roztwór 269 mM roztworu (3-merkaptopropylo)trimetoksysilanu (MPTS) w suchym toluenie.
   2. Dodać 10 ml roztworu do pojedynczych stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Umieścić jedno oczyszczone szkiełko nakrywkowe w każdej probówce i zanurzyć je w roztworze.
      UWAGA: Jedno szkiełko nakrywkowe na probówkę o pojemności 50 ml stosuje się w celu zapewnienia tiolowania obu stron podłoża bez zakłócania przez inne podłoża.
   3. Po 4 godzinach umyć każde szkiełko nakrywkowe (cztery prania na szkiełko nakrywkowe) toluenem, mieszaniną etanolu i toluenu w stosunku 1:1 (v/v) i etanolem.
      UWAGA: Odbywa się to poprzez zanurzanie każdego szkiełka nakrywkowego sekwencyjnie w stożkowych probówkach wirówkowych zawierających wymienione roztwory.
   4. Po wypłukaniu podłoża zanurzyć je w etanolu i przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszego użycia.
      UWAGA: W zależności od liczby szkiełek nakrywkowych, metoda ta może stać się pracochłonna ze względu na obróbkę szkiełek nakrywkowych pojedynczo. W przypadku wielu szkiełek nakrywkowych można użyć słoików Columbia, które mieszczą się w kilku szkiełkach nakrywkowych w tym samym czasie.

5. Wytwarzanie matryc mikrodołkowych krzemowych

1. Powłoka parylenowa: Użyj standardowego protokołu opisanego w poprzednich artykułach badawczych, aby pokryć płytki krzemowe parylenem.
2. Mikrofabrykacja: Postępuj zgodnie z protokołem opisanym przez Barua i in., aby zaprojektować i wyprodukować matrycę mikrostudzienek. ​

6. Tworzenie hydrożelu

1. Masowe tworzenie się hydrożelu na szklanych szkiełkach nakrywkowych
   1. Roztwór prekursora hydrożelowego: Dodać 12,5 μl buforu sieciującego do probówki mikrowirówki o pojemności 0,5 ml, a następnie 5,6 μl roztworu dikrylanu PEG-o-NB. Na koniec do mieszaniny dodać 6,9 μl 4-ramiennego roztworu PEG-tiol.
      UWAGA: Dodanie 4-ramiennego tiolu PEG do mieszaniny inicjuje reakcję sieciowania. Dlatego roztwór prekursora hydrożelu należy zużyć natychmiast po wymieszaniu.
   2. W celu enkapsulacji komórek w roztworze prekursora hydrożelu należy postępować zgodnie z krokami 6.1.3-6.1.9.
   3. W celu enkapsulacji komórek, przed krokiem 6.1.1, zaszczepij bufor sieciujący o żądanej gęstości komórek. Jak informowaliśmy wcześniej19, zaobserwowano, że gęstość komórek wynosząca 7,26 × 10⁷ CFU/ml w buforze sieciującym koreluje z gęstością ~ 90 komórek/^mm2 zamkniętych w hydrożelu.
   4. Umieść tiolowane szkiełko nakrywkowe na czystej szalce Petriego. Umieść dwie przekładki (patrz Tabela materiałów) po dwóch przeciwległych stronach szkiełka nakrywkowego.
      UWAGA: Funkcjonalizacja tiolowa szkiełek nakrywkowych jest niezbędna do kowalencyjnego przyłączenia hydrożelu do powierzchni szkiełka nakrywkowego. Odbywa się to poprzez reakcję grup tiolowych na powierzchni i grup akrylowych obecnych w roztworze prekursora hydrożelu.
   5. Zamocuj przekładki na podstawowym szkiełku nakrywkowym, przyklejając je do szalki Petriego.
   6. Odpipetować żądaną objętość roztworu prekursora na niereaktywnym, perfluoroalkilowanym szkiełku podstawowym.
   7. Umieść szkiełko ze szkła perfluoroalkilowego na podstawowym szkiełku nakrywkowym (Rysunek 1C). Odczekaj 25 minut w temperaturze pokojowej na zakończenie tworzenia hydrożelu.
   8. Po żelowaniu delikatnie usuń szkiełko perfluoroalkilowane. Hydrożel pozostanie przymocowany do podstawowego szkiełka nakrywkowego. ​
      UWAGA: W przypadku szkiełek nakrywkowych o wymiarach 18 mm x 8 mm w celu uzyskania membrany o grubości 12,7 μm należy użyć ~7 μl roztworu prekursora (rysunek 1A, B). Użycie większych objętości roztworu prekursora może spowodować, że pod bazowym szkiełkiem nakrywkowym znajdzie się hydrożel. Może to spowodować, że szkiełko nakrywkowe przyklei się do szalki Petriego i pęknie przy próbie usunięcia. Również pozostałości hydrożelu pod szkiełkiem nakrywkowym są problematyczne dla mikroskopii. Konieczne jest delikatne usunięcie niereaktywnego szkiełka ze szkła perfluoroalkilowego, ponieważ szybkie usunięcie może uszkodzić hydrożel.
   9. Umieścić substrat na szalce Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm w określonym pożywce hodowlanej. W tym przypadku zastosowano pożywkę ATGN uzupełnioną spektynomycyną o spektynomycynie 100 μg/ml dla B. subtilis lub 100 μg/ml ampicyliny dla E. coli w temperaturze 37 °C przez 24 godziny hodowli.

7. Przygotowanie materiału do ekstrakcji komórek

1. Przygotowanie uchwytu PDMS (polidimetylosiloksan)
   1. Sklej ze sobą stos dziesięciu szkiełek nakrywkowych o wymiarach 18 x 18 mm i przyklej ten stos szkiełek nakrywkowych do dna szalki Petriego.
   2. Aby wytworzyć uchwyty PDMS, należy wymieszać prekursor PDMS i utwardzacz w stosunku objętościowym 10:1 w plastikowym kubku, odgazować mieszaninę w eksykatorze próżniowym, a następnie wlać mieszaninę na szalkę Petriego.
   3. Utwardzać PDMS przez 90 minut w temperaturze 80 °C. Następnie przetnij wokół zaklejonego taśmą bloku, aby wyjąć uchwyt PDMS i umieść uchwyt PDMS na szklanym szkiełku, aby ułatwić obsługę mikroskopii.
2. Przygotowanie mikrostrzykawki i rurki
   1. Przeciąć 20 cm rurki z PTFE (politetrafluoroetylenu) (0,05 cala średnicy wewnętrznej) i przymocować jeden koniec rurki do strzykawki o pojemności 100 μl w mikrolitrach.
      UWAGA: Do ekstrakcji należy unikać używania pipet, ponieważ pobieranie uwolnionych komórek za pomocą końcówki pipety może uszkodzić powierzchnię hydrożelu i doprowadzić do zanieczyszczenia.

8. Degradacja hydrożelu za pomocą wzorzystego narzędzia do oświetlenia

1. Włącz mikroskop (patrz tabela materiałów). Następnie włącz narzędzie do wzorzystego oświetlenia (patrz Tabela materiałów).
2. Włącz analogowy i cyfrowy moduł sterujący źródła światła LED 365 nm. Następnie włącz moduł sterujący źródłem światła LED.
3. Otwórz oprogramowanie mikroskopu i oprogramowanie narzędzia do oświetlenia wzorzystego. Po otwarciu okna konfiguracji sprzętowej wybierz przycisk Załaduj.
   UWAGA: W tym miejscu zostaną załadowane trzy urządzenia. (Kamera innej firmy, moduł sterujący i narzędzie do wzorzystego oświetlenia)
4. Naciśnij przycisk Start. Otworzy się teraz okno oprogramowania do modelowania światła. Wybierz pierwszą opcję, przycisk Kontrola urządzeń, na lewym pasku bocznym okna.
5. Skalibruj narzędzie do oświetlenia wzorzystego.
   UWAGA: Kalibrację należy przeprowadzić przy użyciu tego samego obiektywu mikroskopu i filtra, które będą używane do ekspozycji na światło.
   1. Ustaw obiektyw mikroskopu na 10-krotne powiększenie.
      UWAGA: To powiększenie zapewnia wystarczającą odległość roboczą między soczewką mikroskopu a powierzchnią próbki. Pozwala również na monitorowanie i rejestrowanie procesu pobierania w czasie rzeczywistym przez okno obrazu.
   2. Ustaw soczewkę mikroskopu i filtr na ustawienia używane do ekspozycji na światło i umieść lustro kalibracyjne pod mikroskopem.
   3. W oknie Device Control (Kontrola urządzeń) naciśnij zakładkę LED Control (Sterowanie diodami LED). Włącz diodę LED #1 i ustaw natężenie światła na żądaną liczbę. W standardowych eksperymentach ekstrakcji wartość ta jest ustawiona na 60%.
   4. Naciśnij zakładkę zatytułowaną nazwą produktu narzędzia do wzorzystego oświetlenia w oknie Kontrola urządzeń. Następnie naciśnij przycisk Pokaż siatkę.
      UWAGA: Wzór siatki zostanie wyświetlony na lustrze kalibracyjnym.
   5. Dostosuj ostrość mikroskopu i ekspozycję kamery, aby uzyskać wysoką jakość obrazu siatki, a w razie potrzeby obróć kamerę, aby wyrównać linie siatki równolegle do ramki okna kamery.
   6. Wybierz przycisk Kreator kalibracji pod zakładką zatytułowaną nazwą produktu narzędzia do wzorzystego oświetlenia i postępuj zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez oprogramowanie w tym oknie. UWAGA: Otworzy się okno konfiguracji kamery innej firmy.
   7. Otworzy się okno wyboru typu kalibracji. Wybierz opcję Automatyczna kalibracja i naciśnij przycisk Dalej.
   8. Gdy otworzy się okno Regulacja wstępnej kalibracji, postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania i naciśnij przycisk Dalej.
   9. Gdy otworzy się okno Informacje o mapowaniu, zapisz tę kalibrację odpowiednio w żądanym folderze. Odbywa się to poprzez wpisanie daty, nazwy mikroskopu, soczewki obiektywu i filtra.
   10. Po kalibracji naciśnij przycisk Definicja obszaru roboczego znajdujący się pod zakładką zatytułowaną nazwą produktu narzędzia do wzorzystego oświetlenia, aby w razie potrzeby zdefiniować obszar roboczy narzędzia do wzorzystego oświetlenia.
6. Sekcja projektowania sekwencji do przygotowania wzoru.
   1. Naciśnij przycisk Projektowanie sekwencji na lewym pasku bocznym okna oprogramowania. Następnie naciśnij przycisk Edytor sekwencji profili.
   2. Gdy otworzy się okno Edytor sekwencji profili, wybierz opcję Nowy profil w obszarze Lista profili.
      UWAGA: Teraz otworzy się okno Edytora wzorców.
   3. Przygotuj żądany wzór do ekspozycji na światło, wybierając różne kształty i rozmiary wzoru lub ręcznie rysując wzór, jeśli chcesz.
   4. W przypadku wzorów kół i łamanych krzyży dla hydrożelu luzem, wykonaj kroki 8.6.5- 8.6.6
   5. W przypadku wzorów okręgów zdefiniuj okrąg o średnicy 30 μm nad docelową kolonią bakterii, aby pokryć całą kolonię. Wybierz kolor wypełnienia kształtu: biały.
   6. W przypadku łamanych wzorów krzyżowych wybierz kształt prostokąta z okna rysunku wzoru o wymiarach 3 μm x 8 μm. Umieść cztery prostokąty o tych wymiarach na krawędziach docelowej kolonii, podczas gdy połowa wzorów ma nakładkę z kolonią.
   7. W przypadku wzorów okręgów i pierścieni dla układów mikrostudzienek wykonaj kroki 8.6.8-8.6.10.
   8. W przypadku wzorów kołowych narysuj okrąg o średnicy 10 μm wokół obwodu studni. Wybierz kolor wypełnienia kształtu: biały.
   9. Aby uzyskać wzór pierścienia, narysuj okrąg o średnicy 20 μm, umieść go nad studzienką i wybierz kolor wypełnienia kształtu: biały.
   10. Narysuj kolejny wzór koła o średnicy 10 μm z czarnym kolorem wypełnienia i umieść go na obwodzie studni.
7. Edytuj deseń i modyfikuj kształty w oparciu o żądaną metodę wyodrębniania. Upewnij się, że żądany wzór znajduje się w obszarze roboczym narzędzia do oświetlenia z wzorem.
8. Umieść próbkę w uchwycie PDMS i odpipetuj określone media na wierzchu próbki, aby zapobiec odwodnieniu próbki i zapewnić roztwór nośnikowy dla uwolnionych komórek.
9. Następnie zastąp go lustrem kalibracyjnym.
10. Dostosuj ostrość mikroskopu, aby uzyskać ostry obraz kolonii w hydrożelu. Sprawdź kolonie, aby zidentyfikować interesującą Cię kolonię.
11. Tutaj zaprojektuj wzory świetlne, podczas gdy widok kamery pokazuje kolonie wewnątrz próbki, aby przetestować różne wzorce ekstrakcji komórek.
12. Zapisz zdefiniowany wzorzec. Po zapisaniu zdefiniowanego wzorca należy wybrać sekcję Kontrola sesji.
13. W tej sekcji, pod zakładką zatytułowaną nazwą produktu narzędzia do wzorzystego oświetlenia, dodaj zapisaną sekwencję.
14. Po dodaniu sekwencji wybierz opcję symulacji wzoru, aby wyświetlić i dostosować do żądanego miejsca ekspozycji.
    UWAGA: Lokalizację próbki można tutaj dostosować, aby zapewnić precyzyjne odwzorowanie wzoru w docelowym obszarze.
15. Następnie ustaw natężenie światła na 60%, a czas naświetlania na 40 s pod zakładką sterowania LED i rozpocznij proces naświetlania.
16. Monitoruj degradację hydrożelu w czasie rzeczywistym i w trybie jasnego pola, aby zapewnić uwalnianie komórek.
    UWAGA: Zapobiegaj wszelkim ruchom próbki podczas ekspozycji na światło, ponieważ może to spowodować degradację niepożądanych obszarów hydrożelu, powodując zanieczyszczenie krzyżowe.

9. Pobieranie komórek

1. Po ekspozycji na światło 365 nm i uwolnieniu komórek, komórki są zbierane za pomocą mikrolitrowej strzykawki i rurki mikroprzepływowej (ryc. 2).
   UWAGA: Pobieranie komórek należy wykonać natychmiast po ekspozycji wzorca. Pozwala to na miejscową regenerację komórek, zanim uwolnione komórki odejdą od napromieniowanego obszaru.
2. Zmień mikroskop z jasnego pola na filtr FITC lub TRITC, aby umożliwić wizualizację odsłoniętego obszaru próbki gołym okiem.
3. Po zlokalizowaniu odsłoniętego obszaru umieść koniec rurki na napromieniowanym miejscu. Następnie zmień filtr mikroskopu z powrotem na jasne pole, aby monitorować pobieranie komórek w czasie rzeczywistym.
4. Użyj strzykawki dołączonej do drugiego końca rurki, aby ostrożnie pobrać uwolnione komórki. Pobrać 200 μl roztworu i umieścić roztwór w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu analizy DNA lub posiewu.

Results

Rysunek 1: Tworzenie hydrożelu na szkiełkach nakrywkowych ze szkła tiolowanego. (A) Przekładki o grubości 12,7 μm umieszcza się po dwóch przeciwległych stronach szkiełka nakrywkowego zawierającego reaktywne grupy tiolowe. (B) Roztwór prekurs...

Materials