Oznaczanie ilościowe alginianu bakteryjnego przy użyciu testu karbazolu z kwasem uronowym

Streszczenie

Źródło: Al Ahmar, R., et al. Hodowla wariantu Pseudomonas aeruginosa w małej kolonii i ocena ilościowa jego alginianu. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film przedstawia test kolorymetryczny do ilościowego oznaczania alginianów wytwarzanych przez Pseudomonas aeruginosa, przy użyciu karbazolu do wykrywania kwasów uronowych po hydrolizie kwasów. Metoda umożliwia analizę porównawczą produkcji alginianów znormalizowanych do biomasy bakteryjnej w badaniach naukowych i klinicznych.

Protokół

1. Test karbazolu kwasu uronowego

1. Zidentyfikuj pojedynczą kolonię z czystej kultury pożądanego szczepu, który ma być przetestowany. Za pomocą sterylnej wykałaczki zbierz kolonię i umieść wykałaczkę w probówce hodowlanej zawierającej 5 ml bulionu izolacyjnego Pseudomonas (PIB). Hodować w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
   NUTA: Następujące szczepy, PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB i PAO581pyrD, hodowano na płytkach PIA (agar izolacyjny Pseudomonas ) lub płytkach PIA uzupełnionych 0,1 mM uracylem w celu zebrania alginianu do pomiaru.
2. Na podgrzaną płytkę PIA dodaj 150 μl bulionu PIB (dla płytek 15 mm x 100 mm) lub 450 μl bulionu (dla płytek 15 mm x 150 mm). Za pomocą sterylnego rozsiewacza komórek rozprowadź bulion na talerzu. Hodować płytkę w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
   NUTA: Odessać nadmiar płynu, jeśli występuje, z płytki za pomocą pipety, przechylając płytkę na bok. Zarówno płytki PIB, jak i PIA użyte w protokole zawierają 20 ml/l glicerolu, który komórki wykorzystują jako źródło węgla wspomagające produkcję alginianów.
3. Za pomocą kontrolera pipet i sterylnej pipety o pojemności 50 ml dodaj 0,85% NaCl (chlorek sodu) do uprawianego trawnika i zbierz próbkę, zeskrobując płytkę za pomocą rozsiewacza komórek. Odessać próbkę za pomocą świeżej pipety o pojemności 50 ml do probówki zbiorczej o pojemności 50 ml. Wirować próbkę na wysokim poziomie, aby wymieszać i umieścić próbki na lodzie.
   NUTA: Objętość dodanego 0,85% NaCl różni się w zależności od wielkości płytki. W przypadku płytek 15 mm x 100 mm użyj 10−30 ml, a w przypadku płytek 15 mm x 150 mm użyj 20−50 ml.
4. Zmierzyć gęstość optyczną próbek przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀), dodając 1 ml próbki do jednorazowej kuwety i odczytując średnicę zewnętrzną za pomocą spektrofotometru. Powtórz ten krok 2 razy, aby uzyskać potrójną liczbę odczytów dla każdej próbki.
5. Dodaj 3 ml roztworu kwasu siarkowego/boranu do probówek hodowlanych i pozostaw na lodzie. Powoli dodać 350 μl pobranej próbki do mieszanki kwasów w probówkach i krótko wirować na małym ogniu.
   1. Przygotuj bulion boranowy, dodając 10,099 g wodorotlenku potasu (KOH) w proszku do 45 ml wody. Do mieszaniny dodać 24,74 g kwasu borowego (_H3BO3) i doprowadzić objętość do 100 ml.
   2. Umieść butelkę o pojemności 1 l w zlewie z lodem i napełnij ją 500 ml stężonego kwasu siarkowego. POWOLI dodawać 15 ml przygotowanego bulionu boranowego. Pozostaw butelkę do ostygnięcia.
   3. Dodaj kolejne 10 ml bulionu boranowego, co daje w sumie 25 ml. Po schłodzeniu butelki zwiększ objętość do 1 l.
      OSTROŻNOŚĆ: Metoda ta polega na zastosowaniu wysoko stężonego kwasu siarkowego. W celu zapewnienia bezpieczeństwa należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i przestrzegać właściwego protokołu usuwania próbki.
      NUTA: W celu kontroli dodatniej pobiera się znane stężenie kwasu D-mannuronowego i/lub znaną próbkę alginianu bakteryjnego i oczyszcza się go za pomocą szczepów P. aeruginosa wytwarzających alginiany (np. PAO581-PAO1mucA25). W celu kontroli ujemnej należy użyć 0,85% roztworu NaCl i/lubPAO1Δ algD (delecja genu algD w ramce, która sprawia, że bakterie są całkowicie niezdolne do wytwarzania alginianu). Z każdej próbki można wykonać wiele probówek, aby zwiększyć liczbę powtórzeń technicznych, aby pomóc w analizie statystycznej. Przygotuj 3-5 probówek z każdej próbki.
6. Dodać 100 μl 0,1% karbazolu w roztworze etanolu do mieszaniny kwas/próbka. Zakryj rurkę i wiruj na średnim ustawieniu przez 5 sekund. Umieścić w suchej kąpieli w temperaturze 55 °C na 30 minut.
7. Po inkubacji wyjąć probówki i krótko wirować na wysokich obrotach i pozostawić do ostygnięcia na 5 minut.
   NUTA: Kolor, który ma być widoczny, byłby odcieniem fioletu. Kolor pozostanie stabilny do pomiaru przez 1-2 godziny.
8. Odczytać OD₅₃₀ każdej probówki, dodając 1 ml mieszaniny do czystej kuwety i odczytując OD próbek przy 530 nm na spektrofotometrze. Użyj probówki z 0.85% NaCl jako ślepej próby w spektrofotometrze.
9. Przygotować krzywą wzorcową, mierząc OD₅₃₀ seryjnych rozcieńczeń znanych stężeń kwasu D-mannuronowego (1,024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/mL, 16 μg/ml i 8 μg/ml). Powtórz 2 razy. Wyodrębnij równanie liniowe z tych odczytów.
   NUTA: Krzywą standardową należy wykonać tylko raz. Wyodrębnione z niego równanie liniowe można wykorzystać do późniejszych testów.
   1. Obliczyć stężenie alginianu w każdej próbce, stosując krzywą wzorcową i podzielić stężenie alginianu z równania liniowego przez OD₆₀₀ , aby otrzymać całkowitą ilość alginianu na OD₆₀₀.

Materiały