$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ELISA do oznaczania ilościowego alginianów
1. Za pomocą mikropipety dodać 50 μl pobranej próbki do niepoddanej działaniu substancji płytki 96-dołkowej. Dodać 50 μl buforu powlekającego (bufor węglanowy/wodorowęglanowy o pH 9,6) do studzienek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
NUTA: Do kontroli dodatniej można zastosować znane stężenie kwasu D-mannuronowego i/lub znanego stabilnego szczepu wytwarzającego alginian (np. PAO581-PAO1mucA25). Do kontroli ujemnej należy użyć 0,85% roztworu NaCl i/lubPAO1Δ algD (delecja genu algD w ramce sprawia, że bakterie są całkowicie niezdolne do wytwarzania alginianu). Z każdej próbki można wykonać wiele dołków, aby zwiększyć liczbę powtórzeń technicznych, aby pomóc w analizie statystycznej. Przygotuj 3-5 dołków każdej próbki.
2. Za pomocą butelki ze spryskiwaczem umyj dołki płytkowe 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) z 0,05% Tween 20 (PBS-T), napełniając dołki, a następnie opróżniając je, odwracając płytkę.
3. Za pomocą mikropipety dodaj 200 μl buforu blokującego (10% odtłuszczonego mleka w PBS-T) do studzienek. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
NUTA: Zawiń talerz w folię parafinową lub folię termokurczliwą, aby uniknąć parowania w lodówce.
4. Za pomocą butelki ze spryskiwaczem umyj dołki talerzowe 2x PBS-T, napełniając dołki, a następnie opróżniając je, odwracając płytkę.
5. Za pomocą mikropipety dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego (mysie przeciwciało monoklonalne antyalginianowe) do studzienek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny.
NUTA: Przeciwciało pierwszorzędowe (mysie przeciwciało monoklonalne antyalginianowe) podano w stężeniu 0,5 μg/ml (rozcieńczenie 1:2,000 z 1 mg / ml zapasu) w roztworze rozcieńczalnika przeciwciał (1% mleko odtłuszczone w 1x PBS).
6. Za pomocą butelki ze spryskiwaczem umyj dołki talerzowe 3x za pomocą PBS-T, napełniając dołki, a następnie opróżniając je, odwracając talerz.
7. Za pomocą mikropipety dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do studzienek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny.
NUTA: Zastosowano przeciwciało drugorzędowe przeciwko mysiej peroksydazie polichrzanowej (HRP) o stężeniu 0,25 μg/ml (rozcieńczenie 1:2 000 z 0,5 mg/ml bulionu) w roztworze rozcieńczalnika przeciwciała.
8. Za pomocą butelki ze spryskiwaczem umyj dołki talerzowe 3x za pomocą PBS-T, napełniając dołki, a następnie opróżniając je, odwracając płytkę.
9. Za pomocą mikropipety dodać 100 μl roztworu TMB (3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny)-ELISA (test immunoenzymatyczny) (tabela materiałów) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.
NUTA: Kolorem pozytywnej reakcji byłby odcień niebieskiego.
10. Za pomocą mikropipety dodać 100 μl roztworu zatrzymującego (2 N kwas siarkowy).
NUTA: Kolor zmieni kolor z niebieskiego na żółty po dodaniu roztworu zatrzymującego. Kolor utrzymuje się do 30 minut po zatrzymaniu reakcji.
11. Za pomocą czytnika płytek odczytać średnicę zewnętrzną przy długości fali 450 nm.
12. Sporządzić krzywą wzorcową, mierząc OD450 seryjnych rozcieńczeń znanych stężeń kwasu D-mannuronowego (1,024 μg/ml, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/ml, 32 μg/mL, 16 μg/ml i 8 μg/ml). Powtórz 2 razy. Z tych odczytów wyodrębnij równanie liniowe.
NUTA: Krzywą standardową należy wykonać tylko raz. Wyodrębnione z niego równanie liniowe można wykorzystać do późniejszych testów.
1. Obliczyć stężenie alginianu w każdej próbce przy użyciu krzywej wzorcowej i podzielić stężenie alginianu z równania liniowego przez OD600 , aby otrzymać całkowitą ilość alginianu na OD600.