Modelowanie kolonizacji pochwy myszy przez bakterie beztlenowe

Streszczenie

Źródło: Morrill, S. R., et al. Modele kolonizacji pochwy przez bakterie hodowane beztlenowo. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film przedstawia protokół modelowania kolonizacji pochwy u myszy przy użyciu bakterii beztlenowych opornych na antybiotyki. Rozpoczyna się od leczenia hormonalnego w celu zwiększenia podatności nabłonka, a następnie inokulacji dopochwowej i koinokulacji w warunkach beztlenowych. Procedura kończy się pobraniem próbek po inokulacji i hodowlą w celu oceny kolonizacji bakteryjnej i tworzenia biofilmu.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie inokulum

NUTA: Sekcja ta zawiera ogólne etapy przygotowania inokulacji z opornej na streptomycynę bakterii Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR hodowanej beztlenowo. Wszystkie kroki opisane w tej sekcji należy wykonać w komorze beztlenowej.

1. Wszelkie odczynniki, w tym przygotowany bulion nowojorski III (NYCIII), agar i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), należy umieścić w komorze beztlenowej w celu zrównoważenia przez co najmniej 24 godziny przed użyciem.
   NUTA: W tym przypadku zastosowano winylową komorę beztlenową zrównoważoną 5% mieszanką wodoru gazowego. Wewnętrzne stężenie tlenu zwykle wynosi 0 ppm, chociaż mogą wystąpić przejściowe wzrosty niskiego poziomu (10-25 ppm) podczas cyklicznego wprowadzania materiałów do komory.
2. Dwa dni przed inokulacją dopochwową rozprowadź Gardnerella z zamrożonego wywaru glicerolowego na płytkę agarową NYC III w komorze beztlenowej. Użyj małego pojemnika (takiego jak puste pudełko na końcówki do pipet) wypełnionego suchym lodem, aby utrzymać zapas glicerolu zamrożony podczas transportu do i z komory.
3. Na 1 dzień przed inokulacją dopochwową należy użyć 5-10 pojedynczych kolonii Gardnerella z płytki, aby zaszczepić 10 ml bulionu NYC III. Pozostawić płynną kulturę do wzrostu przez noc przez 16 godzin w temperaturze 37 °C. Dodać drugą 1 ml podwielokrotność pożywki, która pozostała niezaszczepiona, i inkubować ją razem z zaszczepioną kulturą, aby potwierdzić, że pożywka nie jest zanieczyszczona.
4. Przygotować inokulum z płynnej kultury, jak opisano poniżej. Przygotowanie inokulum należy w miarę możliwości przeprowadzić w komorze beztlenowej.
   1. Oznaczyć gęstość optyczną kultury (OD), dodając 200 μl kultury do 800 μl świeżej pożywki w kuwecie o pojemności 1,5 ml (rozcieńczenie 1:5). Użyć spektrofotometru do pomiaru gęstości (OD) rozcieńczonej kultury przy długości fali 600 nm (użyć oddzielnej kuwety z samą świeżą pożywką jako ślepą próbą). Pomnóż odczyt OD przez 5, aby uzyskać rzeczywisty OD₆₀₀ z 16-godzinnej hodowli.
   2. Oblicz objętość inokulum potrzebną do eksperymentu. Na przykład, aby zarazić 15 myszy inokulum w ilości 20 μl na mysz, potrzeba 15 x 20 μl = 300 μl inokulum. Przygotuj około 25% więcej inokulum niż potrzeba, więc dla 15 myszy przygotuj 300 μL + (0,25 x 300 μL) = 375 μL inokulum.
   3. Używając OD₆₀₀ oznaczonej w kroku 1.4.1, obliczyć objętość 16-godzinnej hodowli, która musi zostać odwirowana i ponownie zawieszona, aby uzyskać inokulum OD₆₀₀ = 5,0 w objętości obliczonej w kroku 1.4.2. Na przykład, jeśli OD₆₀₀ w kulturze wynosi 1,5, a potrzebna objętość inokulum wynosi 375 μl, to objętość kultury do odwirowania wynosi (375 μL x 5)/1,5 = 1250 μL.
   4. Odmierzyć pipetą objętość kultury obliczoną w kroku 1.4.3. do sterylnej probówki do mikrowirówki. Bakterie osadzać przez odwirowanie przy 16 000 x g przez 1-3 minuty.
   5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w beztlenowym PBS z objętością obliczoną w kroku 1.4.2. Inokulum będzie teraz miało obliczony OD₆₀₀ równy 5,0. W stosownych przypadkach należy również przygotować probówkę PBS, która posłuży jako nośnik kontrolny dla myszy w niezakażonej grupie kontrolnej.
5. Przed wyjęciem probówki z inokulum z komory beztlenowej należy przygotować serię seryjnych rozcieńczeń od 1:10 do 1:10 x 10⁶ w PBS. Umieścić na płytce punktowej 5 powtórzeń każdego rozcieńczenia na płytce agarowej za pomocą pipety wielokanałowej w celu określenia jednostek tworzących kolonie lub CFU inokulum. To jest CFU przed inokulacją.
6. Wstępne płukanie pochwy i inokulacja preparatem Gardnerella
   1. Przygotuj probówki do płukania/płukania pochwy w komorze beztlenowej. Pobrać pipetę 70 μl sterylnego, beztlenowego PBS do 1,5 ml probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml oznaczonych numerami myszy. Przygotuj jedną rurkę myjącą na mysz. Szczelnie zamknij rurki i wyjmij je z komory beztlenowej.
   2. Wykonać płukanie dopochwowe na każdej myszy za pomocą 50 μl beztlenowego PBS z poszczególnych probówek przygotowanych w kroku 2.1. Te płukanki dopochwowe są płukankami przed inokulacją i mogą być używane do dalszych pomiarów i testów.
      1. Po podaniu drugiego wstrzyknięcia walerianianu β-estradiolu, umieść każdą mysz na klatce lub czystej, twardej powierzchni, którą może chwycić przednimi łapami. Delikatnie chwyć środkową część ogona i unieś tak, aby kończyny tylne były lekko uniesione, a otwór pochwy odsłonięty.
      2. Za pomocą pipety i końcówki filtra p-200 pobrać 50 μl PBS z rurki myjącej odpowiadającej odpowiedniej myszy. Delikatnie włóż końcówkę pipety do światła pochwy ~2-3 mm i delikatnie odpipetuj objętość 50 μl, 3x-4x.
      3. Przenieś zebrany materiał do mycia (~50 μl) z powrotem do tej samej rurki myjącej, z której pochodzi, pipetując w górę iw dół w probówce do mycia, która nadal zawiera pozostałe 20 μl PBS. Jeśli jest nadmiar śluzu i końcówka zostanie zatkana, użyj czystej końcówki p200, aby zebrać pozostały materiał i umieścić go w tej samej rurce myjącej.
   3. Dopochwowo podawać 20 μl skoncentrowanej zawiesiny bakteryjnej lub środka do kontroli nośnika do pochwy każdej myszy. Zaszczepić każdą mysz bezpośrednio po płukaniu pochwy dla tej myszy (tj. wykonać płukanie i inokulację w sekwencji dla każdej myszy przed przejściem do następnej). Aby uprościć ten proces, użyj dwóch pipet p200 - jednej ustawionej na 50 μl do płukania, a drugiej na 20 μl do inokulacji.
      1. Unieruchom, jak opisano w kroku 2.2.1. Za pomocą końcówki p-200 odpipetuj 20 μl zawiesiny bakteryjnej do pochwy. W przypadku eksperymentów z jednoczesnym inokulacją przy użyciu dwóch różnych gatunków/szczepów bakterii, należy użyć 10 μl każdej zawiesiny bakteryjnej i unikać mieszania dwóch szczepów przed inokulacją.
         NUTA: Całkowita objętość inokulacji nie powinna przekraczać 20 μl, aby uniknąć rozlania się z pochwy.
      2. Kontynuuj trzymanie tylnego końca każdej myszy przez 10-20 sekund, aby zapobiec natychmiastowemu gromadzeniu się podanej objętości w introicie pochwy. Następnie umieść mysz w nowej klatce/pojemniku lub z towarzyszami z klatki, którzy zostali już zaszczepieni.
      3. Powtórz krok 2.2. i krok 2.3. dla każdej myszy. Nigdy nie umieszczaj myszy z powrotem w klatce ze zwierzętami, które nie zostały jeszcze zaszczepione. Zapobiega to przypadkowemu narażeniu myszy na bakterie oporne na streptomycynę przed inokulacją.
   4. Po zaszczepieniu wszystkich myszy, wprowadź probówkę z inokulum z powrotem do komory beztlenowej. Przygotować i nanieść na talerz kolejne seryjne rozcieńczenie, jak opisano w kroku 1.5. To jest CFU po inokulacji. Porównaj jtk z płytek po inokulacji i przed inokulacją, aby określić, czy żywotność inokulum zmniejszyła się poza komorą beztlenową podczas inokulacji zwierząt.
   5. Pokryj płytki z płukankami pochwy zebranymi w kroku 2.2. na selektywnym agarze (w tym przypadku 1 mg/ml streptomycyny). Inkubować płytki przez 1-2 dni w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C i badać wzrost. UWAGA: Wzrost wskazuje, że endogenni członkowie mikrobiomu są oporni na marker selekcyjny i dlatego mogą zaciemniać liczenie CFU organizmu docelowego.
7. Pobieranie płukanek z pochwy w celu określenia żywotnej kolonizacji Gardnerella
   1. Zbierz płyny do płukania pochwy w wybranych punktach czasowych, aby przeanalizować kolonizację pochwy. Zbierz zgodnie z opisem w kroku 2.2.
   2. Natychmiast po pobraniu należy przekierować płukanie pochwy do komory beztlenowej. Użyć 10 μl każdego płukania do przeprowadzenia seryjnego rozcieńczania i powlekania na selektywnym agarze zgodnie z opisem w kroku 1.5. Użyj liczby CFU jako miary kolonizacji pochwy przez Gardnerella (lub inny beztlenowiec będący przedmiotem zainteresowania).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
17-walerianian β-estradiolu	Sigma	E1631 powiedział:	estrogenizacja myszy
1x PBS (Biblioteka PBS)	Rybak	MT21040CM	płukanie pochwy, przygotowanie inokulum G. vaginlalis , pobieranie tkanek i homogenizacja
Komora beztlenowa	Coy	7200000	Rozwój bakterii beztlenowych
Agar baktonowy	Rybak	DF0140074	G. vaginalis, F. nucleatum i P. bivia płytki agarowe
Glukoza	Sigma	Zobacz materiał G7528	Pożywka NYCIII dla wzrostu G. vaginalis
HEPESY	Komórka	25-060-CL	Pożywka NYCIII dla wzrostu G. vaginalis
Surowica konia	Hemostat	Zobacz materiał SHS500	Pożywka NYCIII dla wzrostu G. vaginalis
Mieszanina wodoru gazowego (5% wodoru, 10% CO₂, 85% azotu)	Matheson		Gaz do komory beztlenowej
Oczyszczacz wody Milli-Q	Milipory	IQ-7000	do wytwarzania pożywek i homogenizacji
Zawartość NaCl	Sigma	S3014 powiedział:	Pożywka NYCIII dla wzrostu G. vaginalis
Azot gazowy	Gaz powietrzny		Gaz do komory beztlenowej
Końcówki filtra P-200	Życiorys ISC	P-1237-200	Płukanie pochwy i inokulacje bakteryjne
Olej sezamowy	Rybak	ICN15662191	estrogenizacja myszy
Spektrofotometr	Powłoka BioChrom	80-3000-45	pomiar bakteryjnego OD₆₀₀
Streptomycyny	Gibco (firma Gibco)	11860038	Dodaj do podłoża agarowego, aby uzyskać selektywne płytki
Ekstrakt drożdżowy	Rybak	DF0127-17-9	Pożywka NYCIII dla wzrostu G. vaginalis