Miejscowe dostarczanie bakterii do światła jelita larwy danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji

Streszczenie

Źródło: Li, J. i wsp. Opracowanie modelu zakażenia larw danio pręgowanego w kierunku Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film pokazuje oparte na mikroiniekcjach dostarczanie znakowanych fluorescencyjnie Clostridioides difficile do światła jelita znieczulonej larwy danio pręgowanego. Przedstawiono w nim etapy przygotowania larw, wstrzyknięcia bakterii i potwierdzenia lokalizacji bakterii w jelicie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Wstrzykiwanie barwionych Clostridioides difficile do larw danio pręgowanego

1. Znieczulić 20–30 larw danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia (określanych tutaj jako 5 dpf) 0,02%–0,04% trikainy (proszek trikainy rozpuszcza się w wodzie podwójnie destylowanej i dostosowuje do pH = 7 za pomocą 1 M roztworu Tris-HCL) w 30% pożywce Danieau ~10 min przed wstrzyknięciem. Przenieś znieczulone larwy na świeżą 10 cm szalkę Petriego i usuń nadmiar 30% pożywki Danieau.
2. Umieść kroplę 0,8% niskotopliwej agarozy na larwach danio pręgowanego, aby się przykryły. Delikatnie ustaw larwy w pozycji bocznej. Umieść szalkę Petriego na lodzie na 30–60 sekund, aby niskotopliwa agaroza zastygła. Dodaj 30% pożywki Danieau zawierającej 0,02%–0,04% trikainy, aby pokryć agarozę.
3. Przygotować roztwór do wstrzykiwań. Dodać 1 μl 0,5% czerwieni fenolowej w buforowanym fosforanowym roztworze soli fizjologicznej (PBS) do 9 μl barwionego barwnikiem inokulum Clostridioides difficile , aby uwidocznić proces wstrzykiwania.
4. Załadować skalibrowaną igłę do mikroiniekcji roztworem do wstrzykiwań za pomocą mikroładowarki. Zamontuj załadowaną igłę na mikromanipulatorze i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym.
5. Wyreguluj ciśnienie wtrysku w zakresie 600–900 hPa. Ustawić czas wstrzykiwania na 0,1–0,3 s, aby uzyskać 0,5–1,0 nL. Ustaw igłę w mikromanipulatorze pod kątem ~45° skierowaną w stronę osadzonych larw.
6. Umieść końcówkę igły nad przewodem pokarmowym, w pobliżu porów moczowo-płciowych. Przebić przez agarozę, następnie mięsień końcówką igły, a następnie wprowadzić go do światła jelita i wstrzyknąć 0,5–1,0 nL Clostridioides difficile. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby monitorować wstrzyknięte larwy i pobrać prawidłowo wstrzyknięte larwy do obrazowania konfokalnego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza niskotopliwa (LM)	Pronadisa (Szczep Górski)	8050	Jest stosowany w płytkach agarozowych
BacLight Czerwona plama bakteryjna	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał B35001	Barwnik fluorescencyjny
Szkło kapilarne	Aparatura Harvarda	30-0019	Igły iniekcyjne
Clostridioides difficile			R20291, szczep rybotypu 027, produkcja TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSO	Carl Roth GmbH	A994 powiedział:
FIDŻI	Platforma typu open source		Przetwarzanie obrazu
Mikro wtryskiwacz	Eppendorf powiedział:	5253000017
Mikroskop konfokalny Leica SP8	Księga Leica
Czerwień fenolowa	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P0290
Trikaina	Sigma-Aldrich	E10521 powiedział: