$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Sekcja jelita larwalnego danio pręgowanego w celu odzyskania żywotnych Clostridioides difficile
- Odizoluj przewód pokarmowy od larw, aby przeanalizować obciążenie bakteryjne. Zacznij od eutanazji larw danio pręgowanego za pomocą 0,4% tricainy.
- Zepręgowany krótko opłucz sterylnym 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) i przenieś je na świeżą płytkę agarozową.
- Sekcja danio pręgowanego
- Wbij igłę w grzbietowy pień larw danio pręgowanego w pobliżu głowy, aby unieruchomić danio pręgowanego. Usuń głowę za skrzelami za pomocą lancetu.
- Włóż drugą igłę w środek tułowia grzbietowego. Włóż trzecią igłę do brzucha danio pręgowanego i wyciągnij jelito z jamy ciała.
NUTA: Konieczna jest szczególna ostrożność, aby wyizolować nienaruszone jelito. Jeśli jest to trudne, wykonaj dodatkowe pociągnięcia, aby oddzielić resztę jelita od pozostałych narządów wewnętrznych. - Za pomocą igły do mikroiniekcji przenieś 10-15 jelit do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 μl sterylnego 1x PBS.
- Homogenizuj jelita za pomocą tłuczka, aby rozbić tkankę i przygotować homogenaty. Upewnij się, że tłuczek dotrze do dna probówki, aby całkowicie zakłócić wszystkie jelita.
- Inkubować homogenaty w pożywce hodowlanej C. difficile zawierającej D-cykloserynę i cefoksytynę, z taurocholanem (TCA, kiełkującym zarodnikiem C. difficile ) lub bez niego w komorze beztlenowej.
- Inkubować płytkę beztlenowo przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.