Izolacja i hodowla bakterii Clostridioides difficile z jelita larwalnego danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Li, J., et al., Opracowanie modelu infekcji larwalnego danio pręgowanego dla Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film pokazuje izolację i hodowlę bakterii Clostridioides difficile z jelita larw danio pręgowanego. Zakażone jelito jest preparowane, homogenizowane i inkubowane w selektywnych pożywkach beztlenowych zawierających antybiotyki. Warunki te hamują konkurencyjne drobnoustroje i sprzyjają wzrostowi żywotnych komórek.

Protokół

Sekcja jelita larwalnego danio pręgowanego w celu odzyskania żywotnych Clostridioides difficile

1. Odizoluj przewód pokarmowy od larw, aby przeanalizować obciążenie bakteryjne. Zacznij od eutanazji larw danio pręgowanego za pomocą 0,4% tricainy.
2. Zepręgowany krótko opłucz sterylnym 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) i przenieś je na świeżą płytkę agarozową.
3. Sekcja danio pręgowanego
   1. Wbij igłę w grzbietowy pień larw danio pręgowanego w pobliżu głowy, aby unieruchomić danio pręgowanego. Usuń głowę za skrzelami za pomocą lancetu.
   2. Włóż drugą igłę w środek tułowia grzbietowego. Włóż trzecią igłę do brzucha danio pręgowanego i wyciągnij jelito z jamy ciała.
      NUTA: Konieczna jest szczególna ostrożność, aby wyizolować nienaruszone jelito. Jeśli jest to trudne, wykonaj dodatkowe pociągnięcia, aby oddzielić resztę jelita od pozostałych narządów wewnętrznych.
   3. Za pomocą igły do mikroiniekcji przenieś 10-15 jelit do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 μl sterylnego 1x PBS.
   4. Homogenizuj jelita za pomocą tłuczka, aby rozbić tkankę i przygotować homogenaty. Upewnij się, że tłuczek dotrze do dna probówki, aby całkowicie zakłócić wszystkie jelita.
4. Inkubować homogenaty w pożywce hodowlanej C. difficile zawierającej D-cykloserynę i cefoksytynę, z taurocholanem (TCA, kiełkującym zarodnikiem C. difficile ) lub bez niego w komorze beztlenowej.
5. Inkubować płytkę beztlenowo przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agarozy	Sigma-Aldrich	Nr kat. A2576	Agaroza o bardzo niskiej zawartości żelowania
Agaroza niskotopliwa (LM)	Pronadisa (Szczep Górski)	8050	Jest stosowany w płytkach agarozowych
Clostridioides difficile			R20291, szczep rybotypu 027, produkcja TcdA+/TcdB+/CDT+
Poziomy ściągacz igieł	Sutter instrument Inc	P-87 (samolot P-87)
Mikro wtryskiwacz	Eppendorf powiedział:	5253000017
Taurocholat	Carl Roth GmbH	8149
Trikaina	Sigma-Aldrich	E10521 powiedział: