Odrodzenie i wzrost bakterii kwasu mlekowego

Streszczenie

Źródło: Ayivi, R. i in., Uprawa, wzrost i żywotność bakterii kwasu mlekowego: perspektywa kontroli jakości. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film przedstawia metodę odzyskiwania bakterii kwasu mlekowego zestresowanych zimnem z zamrożonego zapasu glicerolu, przywracania żywotności bakterii poprzez inkubację beztlenową i izolowania aktywnych kolonii w celu ekspansji kultur.

Protokół

1. Protokół aktywacji i kontroli jakości kultur bakterii kwasu mlekowego (LAB)

1. Weź przygotowany zapas glicerolu szczepów LAB (w probówkach wirówkowych o pojemności 2 ml) z zamrażarki o temperaturze -80 °C i nie pozwól im się rozmrozić przed użyciem.
2. Wyczyść i zdezynfekuj otwór probówek wirówkowych 70% alkoholem i delikatnie przemieszaj przed użyciem.
3. Odpipetować około 250 μl (0,25 ml) podstawowej kultury LAB z probówek wirówkowych do świeżych probówek MRS (deMan, Rogosa i Sharpe media) o pojemności 2 ml.
4. Delikatnie wirować, parafilmować probówki i inkubować je beztlenowo przez noc w temperaturze 42 °C przez 12-16 godzin.
5. Weź około 500 μl (0,5 ml) wyhodowanych na noc kultur z probówek MRS o pojemności 2 ml do świeżych probówek MRS o pojemności 7 ml, odwiruj je i inkubuj je beztlenowo przez noc w temperaturze 42 °C przez 12-16 godzin.
6. Ocenić wzrost drobnoustrojów, mierząc gęstość optyczną (OD) lub wzrost kultur przy długości fali 610 nm za pomocą spektrofotometru w zakresie widzialnym w promieniowaniu UV i rejestrując dopuszczalne wyniki w zakresie od 0,7 do 0,9.
7. Umieścić nocne kultury z probówek MRS o pojemności 7 ml na płytkach agarowych MRS i MRCM-PYR (zmodyfikowany wzmocniony pożywka z pirogronianu clostridialnego) i inkubować je beztlenowo przez 72 godziny w temperaturze 42 °C.
8. Wyizolowane kolonie są wybierane z płytek agarowych, przenoszone do świeżych probówek MRS o pojemności 7 ml, delikatnie wirowane i inkubowane beztlenowo przez noc w temperaturze 42 °C przez 12-16 godzin.
9. Przechowywać płytki agarowe zawierające wyizolowane szczepy w temperaturze 4 °C w lodówce przez tydzień.
10. Zmierzyć i potwierdzić OD (między 0,7 a 0,9) z 7 ml probówek MRS kultur LAB wyizolowanych z płytek z prążkami przy 610 nm i użyć ich jako kultur roboczych we wszystkich powiązanych eksperymentach.
11. Aby uzyskać stosunek 1:10, wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenia (seryjne rozcieńczenia) wyhodowanych kultur LAB z końcowych 7 ml probówek MRS przy użyciu 9 ml wody peptonowej (bufor fizjologiczny).
12. Na koniec weź około 250 μl (0,25 ml) z odpowiednich rozcieńczeń seryjnych do wszystkich eksperymentów fermentacyjnych.
13. Aktywować bulion zawierający szczepy (250 μl) z kroku 2.12, przenosząc je do świeżego 7 ml bulionu MRS i inkubując beztlenowo w temperaturze 42 °C przez 16 godzin.
    NUTA: Wszystkie szczepy L. bulgaricus aktywowano w świeżo przygotowanym bulionie MRS, a następnie inkubowano beztlenowo w temperaturze 42 °C przez 16 godzin w celu osiągnięcia gęstości optycznej (OD₆₁₀ nm) wzrostu bakterii między 0,7 a 0,9. Wzrost bakterii mierzono za pomocą spektrofotometru UV widzialnego przy długości fali 610 nm. Wartości pH kultur nocnych mieściły się w zakresie od 3,5 do 5,3 w wyniku produkcji kwasu mlekowego, organicznego produktu końcowego fermentacji LAB. Przestrzegano i przestrzegano procedur bezpieczeństwa, takich jak prawidłowa cyrkulacja powietrza w okapie bezpieczeństwa biologicznego i unikanie oparzeń podczas użytkowania palnika Bunsena.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Błękit anilinowy	Thermo Scientific	Czynnik R21526	25 gramów
Ekstrakt z wołowiny	Międzynarodowe produkty badawcze	50-197-7509	500 gramów
Ekstrakt drożdżowy	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP1422-500	500 gramów
Chlorek wapnia dwuwodny	Fisher Naukowy	Zobacz materiał C79-500	500 gramów
Dekstroza bezwodna	Fisher Naukowy	BP350500	500 gramów
D-fruktoza	ACROS Organics	AC161355000	500 gramów
Proszek agarowy Difco	Firma Difco	DF0812-07-1	2 kg
Agar TPY	Firma Difco	211921	500 gramów
Probówka do mikrowirówek Eppendorf (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)	Fisher Naukowy	05-402-12	2 ml
Glicerol	Thermo Scientific	PI17904	500 ml
Inkubator CO₂ na podczerwień	Forma Scientific
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)	ATCC 11842 (wersja angielska)
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bułgaria	Trasa S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bułgaria	LB6 powiedział:
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Laboratorium Mikrobiologii i Biotechnologii Żywności (NCATSU)	KAWKA
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Laboratorium Mikrobiologii i Biotechnologii Żywności (NCATSU)	E22 powiedział:
Lactobacillus reuteri (Lactobacillus reuteri)	Biogai, Raleigh / Laboratorium Mikrobiologii i Biotechnologii Żywności (NCATSU)	Kanał RD2
Chlorowodorek L-cysteiny jednowodny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C6852-25G	25 gramów
Maltoza jednowodna	Fisher Naukowy	Zobacz materiał M75-100	Opakowanie 100 gramów
Rosół MRS	Neogen (Neogen)	50-201-5691	5 kg
Pepton nr 3	Hach	50-199-6719	500 gramów
Fosforan potasu dwuzasadowy (K₂HPO₄)	Międzynarodowe produkty badawcze	50-712-761	500 gramów
Octan sodu trójwodny	Fisher Naukowy	Zobacz materiał S220-1	1 kg
Chlorek sodu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP358-1	1 kg
Pirogronian sodu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP356-100	Opakowanie 100 gramów
Probówki z gumowymi nakrętkami	Fisher Naukowy	FB70125150	Wymiary: 25 x 150 mm
Animacja 80	Fisher Naukowy	Zobacz materiał T164-500	500 ml
Zamrażarka o bardzo niskiej temperaturze	Tak niski
Uracyl	ACROS Organics	AC157301000	Opakowanie 100 gramów
Spektrofotometr UV - światło widzialne	Thermo Fisher Naukowy	Ewolucja 201
Dżin wirowy 2	Fisher Naukowy
Ekstrakt drożdżowy	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP1422-500	500 gramów
Etanol	Fisher Naukowy	T08204K7	4 L
Kwas solny (6N (certyfikowany), Fisher Chemical)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał SA56-500	500 ml