Mikrobiologicznie indukowane wytrącanie kalcytu przez Sporosarcina pasteurii

Streszczenie

Źródło: Bhaduri, S., et al., Mikrobiologicznie indukowane wytrącanie kalcytu za pośrednictwem Sporosarcina pasteurii. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film przedstawia metodę wzbogacania Sporosarcina pasteurii w mocznik i chlorek wapnia w celu wywołania aktywności ureazy, co prowadzi do powstania widocznych kryształów kalcytu poprzez mikrobiologicznie indukowane wytrącanie kalcytu lub MICP.

Protokół

1. Protokół wzbogacania składników odżywczych w celu przyspieszenia wytrącania

1. Przenieść 9 ml przygotowanego płynu hodowlanego (komórki + pożywka) do kilku wysterylizowanych probówek wirówkowych, każda o objętości 10 ml każda.
2. Przygotować 100 ml roztworu podstawowego do zewnętrznego wzbogacania, składającego się z czterech składników w następujących stężeniach w pożywce świeżej: mocznik: 2 g/l, chlorek amonu: 1 g/l, wodorowęglan sodu: 212 mg/l, chlorek wapnia: 280 mg/l. Dokładnie odmierzyć wszystkie składniki za pomocą wagi analitycznej i wymieszać wszystko oprócz mocznika ze świeżą pożywką w zlewce i umieścić w autoklawie (121 °C, 15 psi, 15 min).
   1. Po autoklawie zmieszać wymaganą ilość mocznika (2 mg) z 1 ml świeżej pożywki i przepuścić przez strzykawkę wyposażoną w filtr strzykawkowy 0,22 μm, aby zakończyć proces wzbogacania.
   2. Dodać 1 ml tej pożywki wzbogacającej z dodatkami do wysterylizowanych probówek wirówkowych zawierających 9 ml przygotowanej cieczy hodowlanej (komórki + pożywka).
      NUTA: Mocznik, który ulega degradacji w podwyższonych temperaturach, nie może być sterylizowany w autoklawie. W związku z tym, po autoklawowaniu pozostałych składników (121 °C, 15 psi, 15 min), mocznik dodaje się jako ostatni przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
3. Dokładnie wymieszaj każdą rurkę za pomocą mechanicznego wirownika. Umieścić wzbogacone ciecze (komórki + pożywka + dodatki) w inkubatorze bez wstrząsania w temperaturze 30 °C. Regularnie monitorować wszystkie jednostki pod kątem rozpoczęcia wytrącania. Za pomocą mikroskopu świetlnego rozpocznij obserwacje mikroskopowe po wykryciu początku opadów gołym okiem. Zwykle jest to od 30 do 36 godzin po rozpoczęciu eksperymentów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolby z pyreksu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał S63268	Corning Erlenmeyer
Cylinder miarowy	Cole'a-Parmera	CP08559GC	Cole-Parmer Klasa A Cylinder z podziałką z Cal Cert,TC; 1000 ml,1/pk
Waga analityczna	OHAUS	AX124E	Służy do pomiaru masy odczynników
Autoklaw	Brinkmanna	58619000
Taśma do autoklawu	Firma VWR	52428864
Folia aluminiowa	Sigma-Aldrich	Z185140	Służy do uszczelniania kolby przed umieszczeniem jej w autoklawie
Zapas bakteryjny	Cedrowy	11859	-80°C zapas S. pasteurii, nr ATCC jest wymieniony przeciwko Cat. Nie.
Pipety mechaniczne jednokanałowe Mline, o zmiennej objętości	Biohit	725010	Sprzedawany przez firmę VWR pod numerem katalogowym 14005976
Końcówka do mikropipet	Fisher Naukowy	212772B	Służy do drapania płytek agarowych
Inkubator	Spoiwo	80079098	Inkubator mikrobiologiczny, seria BF
Inkubator z wytrząsaniem	Firma VWR	14004300	Stołowe inkubatory z wytrząsaniem VWR Signature
Parafilm	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P7793 TGL	Służy do uszczelniania płytek agarowych
Mocznik	Sigma-Aldrich	U1250	Wzbogacenie na pożywkę
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy S8875 powiedział:	Wzbogacenie na pożywkę
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C1016	Wzbogacenie na pożywkę