$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Inokulacja mikromacierzy polimerowych bakteriami
NUTA: Zapewnij dobrą technikę aseptyczną. Cała praca z kulturami powinna odbywać się w sterylnym środowisku: za pomocą palnika Bunsena lub w okapie przepływowym. Kultury powinny być uprawiane z dostępnością tlenu, podłożem wzrostowym i temperaturą dostosowaną do wymagań każdego gatunku.
- Przygotuj nocne kultury, zaszczepiając 5 ml bulionu Luria-Bertani (LB: 10 g/L baktoo-tryptonu, 5 g/l chlorku sodu, NaCl i 10 g/l ekstraktu drożdżowego) kolonią z talerza. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min (obrotów na minutę).
- Przygotować wywar z nocnych kultur zamrażarkowych przez dodanie glicerolu (stężenie ogólne 10%) i przechowywać wywar w temperaturze -80 °C.
- W celu określenia liczby komórek z próbek rozmrożonych zasobów bakteryjnych, należy wykonać seryjne rozcieńczenia każdego z nich i hodować bakterie przez noc na pożywkach stałych. Dokładne określenie liczby komórek w stadach zapewnia odpowiednią inokulację każdego gatunku.
- Przygotować inokulant do mikromacierzy. Kultury jednogatunkowe są uprawiane jak powyżej i stosowane bezpośrednio do mikromacierzy. BacMix-1 jest mieszaniną bakteryjną Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) i Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 jest mieszaniną bakteryjną składającą się z Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus, K. pneumoniae i Enterococcus faecalis (E. faecalis).
- Aby uzyskać mieszaną kulturę, należy wymieszać przez noc w równych objętościach (po 3 ml każda) i rozcieńczyć czterokrotnie świeżym LB (do około 50 ml końcowej objętości).
- Umieścić mikromacierze polimerowe sterylizowane ultrafioletem na prostokątnych płytkach 4-dołkowych i inkubować je z 6 ml mieszanych kultur bakteryjnych w temperaturze 37 °C z delikatnym mieszaniem (30 obr./min) przez 5 dni.
- Po inkubacji delikatnie przepłukać mikromacierze dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM chlorek potasu, KCl, 10 mM wodorofosforan disodowy, Na2HPO4, 1,8 mM diwodorofosforan potasu, KH2PO4) i inkubować roztworem 1 μg/ml barwienia 4',6-diamidyno-2-fenyloindolowego (DAPI) w PBS przez 30 min.
- Umyj zabarwione szkiełka do mikromacierzy na świeżej płytce studzienki, przykrywając PBS i delikatnie obracając, zmieniając PBS jeden raz. Suszyć pod strumieniem powietrza. Nałóż szklane szkiełko nakrywkowe na szkiełko do mikromacierzy i uszczelnij za pomocą kleju. Po wyschnięciu wysterylizuj zewnętrzną powierzchnię 70% (v/v) etanolem.
- Bezpiecznie utylizuj kultury zgodnie z ich poziomem hermetyczności.
2. Obrazowanie i analiza mikromacierzy
- Rejestruj pojedyncze obrazy dla każdej plamki polimerowej w kanałach jasnego pola i DAPI (wzbudzenie/emisja, Ex/Em = 358 nm / 361 nm). Wykonaj to ręcznie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub za pomocą automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego (ze stolikiem X-Y-Z sterowanym przez oprogramowanie do akwizycji obrazu) wyposażonego w obiektyw 20X.
NUTA: Dostosuj mikroskop, aby uzyskać obrazy przy użyciu kanałów jasnego pola i DAPI. Upewnij się, że wzmocnienie i czas naświetlania obrazu dla wszystkich mikromacierzy są takie same. - Uzyskaj średnią intensywność fluorescencji każdego punktu w kanale DAPI, wybierając obszar plamki i określając ilościowo fluorescencję za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.
- W celu uzyskania fluorescencji tła każdej plamki należy uzyskać obrazy plamek polimerowych na kontruplikowanej mikromacierzy inkubowanej tylko z pożywką bez bakterii. Odejmij fluorescencję tła od intensywności plamki, aby uzyskać fluorescencję od bakterii.
- Oblicz średnią znormalizowaną wartość z czterech plamek reprezentujących każdy polimer, używanych do porównywania wiązań bakterii różnych polimerów.
- Zidentyfikuj polimery, które wykazują najmniejsze wiązanie bakteryjne (najniższą fluorescencję), jako polimery "trafione".