Izolacja bakterii opornych na antybiotyki z próbki wody do analizy molekularnej

Streszczenie

Źródło: Ghadigaonkar, D. i Rath, A. Izolacja i identyfikacja bakterii opornych na antybiotyki na bazie wody oraz charakterystyka molekularna ich genów oporności na antybiotyki. J. Vis. Exp. (2023)

Ten film pokazuje izolację i przygotowanie bakterii opornych na antybiotyki z próbki wody przy użyciu selektywnych pożywek. DNA jest ekstrahowane z bakterii opornych na antybiotyki i amplifikowane w celu identyfikacji genów oporności bakterii na antybiotyki.

Protokół

1. Pobieranie i przetwarzanie próbek

1. Pobieranie próbek
   1. Pobrać odpowiednią objętość próbki wody do sterylnych pojemników na próbki, upewniając się, że nie więcej niż 3/4 pojemnika jest napełnione.
   2. Próbki należy przetransportować do laboratorium w warunkach aseptycznych tak szybko, jak to możliwe po pobraniu i natychmiast je przetworzyć.
2. Przetwarzanie próbek
   1. Próbkę wody należy przefiltrować w aseptyki przez sterylną ściereczkę muślinową, aby usunąć wszelkie cząstki stałe.
   2. Przeprowadzić odpowiednie seryjne rozcieńczenia przefiltrowanej wody do dalszej analizy.

2. Oszacowanie całkowitego obciążenia bakteryjnego i liczby bakterii opornych na antybiotyki

1. Oznaczanie całkowitego obciążenia bakteryjnego
   1. Zawiesić 18,12 g modyfikowanego proszku agaru 2A (agar R2A) firmy Reasoner w 1,000 ml podwójnie destylowanej wody i rozpuścić mieszaninę przez ogrzewanie. Rozpuszczoną mieszaninę należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 funtów na cal kwadratowy (psi) przez 20 minut. Przygotować płytki modyfikowane agarem R2A, wlewając odpowiednią ilość autoklawowanej mieszaniny do sterylnych płytek Petriego (np. dodać około 20 ml autoklawowanego sterylnego podłoża do sterylnej płytki Petriego o średnicy 90 mm).
   2. Po zestaleniu się pożywki równomiernie rozprowadzić 100 μl odpowiednich rozcieńczeń przefiltrowanej próbki wody na zmodyfikowanej płytce R2A Agar. Wykonaj eksperyment w dwóch egzemplarzach.
   3. Inkubować wszystkie powyższe płytki w temperaturze 35-37 °C przez 48 godzin (zmieniać temperaturę i czas inkubacji w zależności od pożywki użytej do izolacji).
   4. Wyrazić całkowite obciążenie bakteryjne w jednostkach tworzących kolonie na mililitr (CFU/ml) za pomocą równania (1):
2. Oznaczanie liczby bakterii AR
   1. Wykonaj kroki 2.1.1-2.1.4. Jednak zamiast agaru R2A, zmodyfikowanych płytek, użyj R2A Agar, zmodyfikowanych płytek uzupełnionych indywidualnie pięcioma różnymi antybiotykami, a mianowicie cefotaksymem (3 μg / ml), cyprofloksacyną (0,5 μg / ml), erytromycyną (20 μg / ml), kanamycyną (15 μg / ml) i wankomycyną (3 μg / ml).
   2. Dodać antybiotyki oddzielnie do probówek zawierających 20 ml sterylnego stopionego agaru R2A, zmodyfikowanego (o temperaturze stopionego agaru R2A, zmodyfikowanego na ≤40 °C) w celu uzyskania końcowego stężenia antybiotyku, jak wspomniano w kroku 2.2.1.
   3. Zawirować w celu równomiernego wymieszania i wylać na sterylne płytki Petriego, zanim agar zastygnie. Wykonaj eksperyment w dwóch egzemplarzach.
   4. Inkubować wszystkie powyższe płytki w temperaturze 35-37 °C przez 48 godzin (temperatura i czas inkubacji mogą się różnić w przypadku użycia innej pożywki).
   5. W celu kontroli jakości i sprawdzenia skuteczności antybiotyków, należy rozprowadzić 100 μl zawiesin bakteryjnych szczepów Escherichia coli ATCC 25922 i Staphylococcus aureus ATCC 29213 na odpowiednich zawierających antybiotyk Agarze R2A, zmodyfikowanych płytkach (upewnić się, że gęstość świeżej kultury użytej do inokulacji wynosi gęstość optyczną, OD = 0,5 przy 600 nm).
   6. Określić liczbę bakterii opornych na antybiotyki w jtk/ml, jak opisano w kroku 2.1.4.

3. Identyfikacja bakterii hodowlanych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rybosomalnego RNA (rRNA)

1. Przygotowanie matrycy DNA z izolatów do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)
   1. Za pomocą sterylnej wykałaczki weź pojedynczą, izolowaną, czystą kolonię izolatu rosnącą na szalce Petriego. Zawiesić kolonię bakteryjną w 100 μl sterylnej, podwójnie destylowanej wody w sterylnej probówce do mikrowirówek i gotować przez 10 minut.
   2. Odwirować zawiesinę o stężeniu 10 000 × g przez 2 minuty w celu osadzenia szczątków i przenieść supernatant do świeżej sterylnej probówki do mikrowirówki w celu wykorzystania jako surowa matryca DNA.
2. Celowana amplifikacja PCR regionu V3 genu 16S rRNA i sekwencjonowanie
   1. Przygotować 40 μl mieszaniny reakcyjnej w probówce do PCR do amplifikacji PCR, jak podano w tabeli 1.
      NUTA: Przygotowanie DNA powinno odbywać się na bloku lodu, minimalizując przy tym ryzyko zanieczyszczenia (podczas pracy z odczynnikami należy nosić rękawice, a powierzchnię roboczą dokładnie czyścić 70% etanolem).
   2. Umieść probówkę w bloku termicznym i uruchom odpowiedni program w termocyklerze PCR. Patrz Tabela 2 , aby zapoznać się ze standaryzowanymi warunkami cyklicznymi PCR i informacjami o starterach do amplifikacji regionów V3 genów 16S rRNA.

Tabela 1: Składniki mastermix PCR. Skład mieszaniny reakcyjnej różnych odczynników PCR.

Odczynniki do PCR	Objętość (μL)
2x Mistrz Taq Mix	20
Starter do przodu (10 piko kretów)	1.5
Podkład odwrotny (10 piko kretów)	1.5
Surowy szablon DNA	1.5
Sterylna woda do biologii molekularnej	15.5
Całkowita objętość	40

 

 

 

 

 

 

 

Tabela 2: Warunki cyklu PCR dla amplifikacji genu 16S rRNA. Przedstawiono warunki cyklu PCR wymagane do amplifikacji genu 16S rRNA. Etapy obejmują początkowy etap denaturacji, po którym następuje 35 cykli denaturacji, wyżarzania i wydłużania oraz ostatni etap przedłużania.

Kierunek	Sekwencja podkładu 5' – 3'	Warunki PCR	Nie. cykli
Naprzód	GGAGGCAGCAGTAAGGAAT	94 °C przez 10 min	1
		Denaturacja w temperaturze 94 °C przez 30 s	35
		Wyżarzanie w temperaturze 50 °C przez 30 s
		Przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 40 s
Rewers	CTACCGGGGTATCTAATCC powiedział:	Końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 min	1

Materiały