System wspólnej uprawy do badania reakcji molekularnych gospodarzy roślinnych i bakterii oddziałujących na siebie

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Nathoo, N., et al. Hydroponiczny system kouprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych roślina/mikroorganizm oraz sygnalizacji. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film przedstawia hydroponiczny system wspólnej uprawy do badania interakcji między roślinami a bakteriami w sterylnych warunkach. Sadzonki roślin przenosi się do sterylnego, kwaśnego podłoża wzrostowego, inkubuje i sprawdza pod kątem zanieczyszczenia przed zaszczepieniem Agrobacterium. Aktywowane bakterie przyczepiają się do korzeni roślin, przenoszą T-DNA do komórek roślinnych i promują zmiany molekularne, które zwiększają kolonizację bakterii.

Protokół

1. Hydroponiczny system wspólnej uprawy

Przygotuj płynne podłoże Murashige i Skoog (MS): 2,165 g/l soli podstawowych MS, 10 g/l sacharozy, 0,25 g/l kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) i 59 ml/l mieszanki witamin B5, pH 5,75.
Podłoże należy sterylizować w autoklawie. Wlej 18 ml do każdego sterylnego cylindrycznego szklanego lub przezroczystego plastikowego zbiornika (naczynia krystalizujące, 100 x 80 mm2) ze sterylnymi pokrywkami.
NUTA: Wstępnie wysterylizuj zbiorniki i pokrywki, owijając je folią aluminiową i sterylizując w autoklawie.
W wysterylizowanym okapie przepływowym użyj sterylnych kleszczyków, aby delikatnie przenieść każdy kwadrat siatki z 10-14-dniowymi sadzonkami z półstałego podłoża do hydroponicznego cylindrycznego zbiornika (rysunek 1d). Uszczelnij pokrywy zbiorników za pomocą porowatej taśmy chirurgicznej.
Uprawiać sadzonki na siatce w zbiorniku przez 72 godziny w temperaturze 22-24 °C, z 16-godzinnym fotoperiodem i wstrząsaniem przy 50 obr./min w celu napowietrzenia (rysunek 1e).
NUTA: Pozwala to roślinom przystosować się do środowiska hydroponicznego przed inokulacją (kouprawą) mikroorganizmami. Ten okres oczekiwania pozwoli również na wykrycie przypadkowego zanieczyszczenia mikrobiologicznego przed inokulacją.
1. Rozpocznij następny krok dzień przed końcem okresu inkubacji.
Hodować Agrobacterium tumefaciens w pożywce agrobacterium (AB) (0,5% m/v ekstraktu drożdżowego, 0,5% m/v tryptonu, 0,5% m/v sacharozy, 50 mM_MgSO4, pH 7,0) w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przez noc, aż kultura osiągnie końcową gęstość optyczną 1,0 przy 600 nm (OD₆₀₀), mierzoną za pomocą spektrofotometru, z nieinokulowaną pożywką AB jako ślepą próbą.
NUTA: OD₆₀₀ wynoszący 1,0 odpowiada około 10⁹ komórkom / ml.
Umyj A. tumefaciens trzy razy w równej objętości 0,85% NaCl. Zawiesić ponownie w równej objętości sterylnej podwójnie destylowanej wody.
Przed inokulacją należy dokładnie zbadać zbiornik z sadzonkami, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia; Pożywka w niezanieczyszczonych zbiornikach powinna być klarowna i przezroczysta.
1. Wyrzuć każdy zbiornik z mętną cieczą (zanieczyszczeniem) i ponumeruj pozostałe zbiorniki. Pobrać niewielką ilość (20 μl) pożywki hydroponicznej z każdego ponumerowanego zbiornika i umieścić ją na szalce Petriego wypełnionej bulionem Luria (LB). Inkubować naczynie w temperaturze 28 °C.
Natychmiast dodaj 50 μl zawiesiny A. tumefaciens (około 5 x 10⁷ komórek, oszacowanych na podstawie OD₆₀₀) do każdego numerowanego zbiornika hydroponicznego. Współhodować siewki Arabidopsis thaliana i A. tumefaciens w temperaturze 22-24 °C z 16-godzinnym fotoperiodem i wstrząsaniem przy 50 obr./min (ryc. 3f).
1. Sprawdź nakrapianą płytkę LB z kroku 1.7.1. po 12 i 28 godzinach inkubacji w celu sprawdzenia sterylności zbiorników. Jeśli występuje jakiekolwiek zanieczyszczenie, nie należy używać odpowiedniego numerowanego zbiornika (zaszczepionego bakteriami) do dalszych testów.
W razie potrzeby należy monitorować wzrost A. tumefaciens w regularnych odstępach czasu, usuwając próbkę pożywki ze zbiornika i mierząc OD₆₀₀ za pomocą spektrofotometru z pożywką z niezaszczepionej kontroli jako ślepą próbę (ryc. 2).
NUTA: Objawy choroby roślin powinny być widoczne po 7 dniach (ryc. 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1: Hydroponiczny system kouprawy roślin i mikroorganizmów. Lewy panel przedstawia schemat blokowy przedstawiający sześć kluczowych kroków w montażu i obsłudze hydroponicznego systemu wspólnej uprawy. Prawy panel demonstruje rzeczywiste ...