$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie roztworu
- Przygotować 1 M Tris-Cl o pH 7,8, rozpuszczając 10,34 g Tris HCl i 4,17 g Tris OH w 50 ml dH2O w kolbie o pojemności 125 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
- Przygotować roztwór A (20 mM MgCl2, 0,7 M sacharozy, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) rozpuszczając 0,10 g MgCl2 (95,2 g/mol) i 11,98 g sacharozy (342,3 g/mol) w 25 ml dH2O w kolbie o pojemności 125 ml. Dodać 500 μl 1 M Tris-Cl (pH 7,8) i dostosować objętość do 50 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
- Przygotować roztwór B (10 mM MgCl2, 0,8 M sacharozy, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) rozpuszczając 0,05 g MgCl2 (95,2 g/mol) i 13,69 g sacharozy (342,3 g/mol) w 25 ml dH2O w kolbie o pojemności 125 ml. Dodać 500 μl 1 M Tris-Cl (pH 7,8) i dostosować objętość do 50 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 0,8 M sacharozy, rozpuszczając 13,69 g sacharozy (342,3 g/mol) w 50 ml dH2O w kolbie o pojemności 125 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 5 mg/ml dezoksyrybonukleazy I (DNazy I), rozpuszczając 0,015 g DNazy I w 3 mldH2O w kolbie o pojemności 50 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm. Podwielokrotny roztwór rozlać do probówek do mikrofug i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Przygotować 0,125 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) o pH 8,0, rozpuszczając 0,698 g dehydratacji disodowej EDTA (372,2 g/mol) w 15 ml dH2O w kolbie o pojemności 125 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 600 μg/ml cefaleksyny, rozpuszczając 0,03 g hydratu cefaleksyny (365,404 g/mol) w 50 ml dH2O w kolbie o pojemności 125 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze 4 °C.
- Przygotować 5 mg/ml lizozymu, rozpuszczając 0,015 g lizozymu w 3 mldH2O w kolbie o pojemności 50 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm. Podwielokrotny roztwór rozlać do probówek do mikrofug i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Przygotować 3% w/v bulionu sojowego z tryptykazą (TSB), rozpuszczając 30 g TSB w 1 ldH2Ow kolbie o pojemności 2 l. Podwielokrotność roztworu rozlać do kolb zawierających 25 ml lub 100 ml TSB, które mają być użyte do przygotowania sferoplastów E. coli . Kolby autoklawe do sterylizacji ciekłego podłoża. Sterylny TSB może być przechowywany w temperaturze pokojowej lub 4 °C.
2. Przygotowanie hodowli przez noc
NUTA: Wykonaj sekcje 2-3 przy użyciu odpowiednich technik sterylnych. W razie potrzeby szczep bakteryjny może zawierać plazmid zwiększający oporność na antybiotyki, aby zmniejszyć potencjalne zanieczyszczenie. Jeśli używasz szczepu z opornością na antybiotyki, dodaj niezbędne antybiotyki w krokach 2.1 i 3.1–3.2.
- Przygotuj posiew na noc, wybierając pojedynczą kolonię bakterii za pomocą sterylnej końcówki pipety i umieszczając ją w probówce hodowlanej o pojemności 14 ml zawierającej 2-3 ml 3% w/v TSB. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez 16–21 godzin.
3. Otrzymywanie Gram-ujemnych sferoplastów E. coli
- W kolbie o pojemności 250 ml rozcieńczyć nocną kulturę w stosunku 1:100 w objętości 25 ml 3% w/v TSB i inkubować roztwór bakteryjny w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez około 2,5 godziny, aż roztwór osiągnie gęstość optyczną 0,5–0,8 przy 600 nm. Zmierz gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru.
- W kolbie o pojemności 250 ml rozcieńczyć tę kulturę w stosunku 1:10 w 30 ml 3% w/v TSB i inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez 2,5 godziny w obecności 60 μg/ml cefaleksyny (347,4 g/mol) w celu wytworzenia włókien jednokomórkowych o długości około 50–150 μm, które można obserwować w powiększeniu 1000x za pomocą mikroskopu świetlnego (ryc. 1B).
- Zebrać włókna przez odwirowanie roztworu bakteryjnego w temperaturze 1 500 x g, 4 °C przez 4 minuty. Zdekantować i odrzucić supernatant, zachowując osad.
- Umyj włókna, delikatnie dodając 1 ml 0,8 M sacharozy, uważając, aby nie naruszyć granulki. Inkubować przez 1 minutę, a następnie odrzucić supernatant bez naruszania osadu.
- Dodać 150 μl 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 μl 5 mg/ml lizozymu, 30 μl 5 mg/ml DNazy I i 120 μl 0,125 M EDTA w odpowiedniej kolejności do osadu i inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 min.
- Dodawać 1 ml roztworu A stopniowo przez 1 minutę do roztworu przygotowanego w 3,5 minuty za pomocą mikropipety, delikatnie obracając roztwór ręcznie. Inkubować roztwór przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
- Umieścić 7 ml roztworu B o temperaturze 4 °C do dwóch stożkowych probówek o objętości 15 ml. Dodać równe ilości roztworu przygotowanego w 3.6 do każdej z tych dwóch probówek. Odwirować roztwór w temperaturze 1 500 x g, 4 °C przez 4 min.
- Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie usunąć wszystkie oprócz 1-2 ml supernatantu, nie naruszając osadu. Zawiesić osad, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą mikropipety P1000. Sprawdź wzrokowo, aby zobaczyć tworzenie się sferoplastów, obserwując próbkę w powiększeniu 1,000x za pomocą mikroskopu świetlnego (ryc. 1C).
- Przechowuj sferoplasty w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia lub do momentu, gdy przejdą przez 3 cykle zamrażania i rozmrażania.
