$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie roztworu
- Przygotować 5 mg/ml lizozymu, rozpuszczając 0,015 g lizozymu w 3 mldH2O w kolbie o pojemności 50 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm. Podwielokrotny roztwór rozlać do probówek do mikrofug i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Przygotować 3% w/v bulionu sojowego z tryptykazą (TSB), rozpuszczając 30 g TSB w 1 ldH2Ow kolbie o pojemności 2 l. Podwielokrotność roztworu rozlać do kolb zawierających 100 ml TSB, które mają być użyte do przygotowania protoplastów B. megaterium . Kolby autoklawe do sterylizacji ciekłego podłoża. Sterylny TSB może być przechowywany w temperaturze pokojowej lub 4 °C.
- Przygotować roztwór C (1 M sacharozy, 0,04 M maleinianu, 0,04 M MgCl2, pH 6,5) rozpuszczając 34,23 g sacharozy (342,3 g/mol), 0,46 g kwasu maleinowego (116,07 g/mol) i 0,38 g MgCl2 (95,21 g/mol) w 100 mldH2O w kolbie o pojemności 250 ml. Dostosuj pH do 6,5. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 200 ml pożywki protoplastowej, mieszając 100 ml 3% w/v TSB i 100 ml roztworu C w szklanej butelce o pojemności 1 l. Autoklaw do sterylizacji roztworu i przechowywania w temperaturze pokojowej.
2. Otrzymywanie protoplastów Gram-dodatnich B. megaterium
- W kolbie o pojemności 250 ml rozcieńczyć nocną kulturę w stosunku 1:1000 w 100 ml 3% w/v TSB i inkubować roztwór bakteryjny w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez około 4,5 godziny, aż roztwór osiągnie gęstość optyczną 0,9-1,0 przy 600 nm. Zmierz gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru.
- Wlać płynną kulturę do dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 2 000 x g, 4 °C przez 10 minut.
- Za pomocą pipety serologicznej wyrzucić supernatant z obu stożkowych probówek. Ponownie zawiesić każdą osadkę w 2,5 ml pożywki protoplastowej i połączyć zawieszone roztwory w jedną stożkową probówkę. Odpipetować połączony roztwór zawieszony do kolby o pojemności 125 ml.
- Dodać 1 ml lizozymu o stężeniu 5 mg/ml i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, wstrząsając.
- Monitoruj wzrost protoplastów w powiększeniu 1000x za pomocą mikroskopu świetlnego, zwracając uwagę na wszelkie nieprawidłowości, takie jak bakterie, które pojawiają się jako spuchnięte pręciki zamiast kulek (ryc. 1). Za pomocą pipety serologicznej przenieść roztwór do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 2 000 x g, 4 °C przez 10 minut.
- Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki protoplastowej. Protoplasty należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia lub do momentu, gdy przejdą przez 3 cykle zamrażania i rozmrażania.
