$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Inokulacja komórek (początek eksperymentu)
- Dokładnie po 2 godzinach wyjąć poranne kultury bakterii z wytrząsarki i odwirować je przez 10 minut (1 900 x g, 4 °C).
NUTA: W przypadku wszystkich kolejnych kroków utrzymuj wszystkie zawiesiny bakteryjne na lodzie, aby zminimalizować wzrost. - Zawiesić osad bakteryjny w pożywce do hodowli tkankowych (TCM) bez antybiotyków. Za pomocą spektrofotometru dostosuj gęstość optyczną (OD) do 0,7-0,9, a następnie rozcieńczyć antybiotykami TCM bez antybiotyków do stężenia 1 x 106 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml (rozcieńczenie około 1:100). Użyj tej zawiesiny bakteryjnej, aby zainfekować każdą wkładkę 1 x 105 CFU na 100 μl objętości.
- Oznaczyć płytkę transwell i zainfekować każdą wkładkę 100 μl inokulum dostosowanego do OD (w sumie 1 x 105 CFU na wkładkę). Test właśnie się rozpoczął. Zanotuj czas i zapisz go jako t = 0 h.
- Zawiesinę bakteryjną inokulum należy umieścić na płytce w celu ilościowego oznaczenia jtk/ml przy użyciu metody rozcieńczania toru, posiażdżając 10 μl podwielokrotności na kwadratowych płytkach agarowych LB.
2. Kwantyfikacja transcytozy
- Co 30 minut po inokulacji napełniaj nowe studzienki 500 μl TCM bez antybiotyków. Przenieś wkładki do tych nowych studzienek za pomocą innego zestawu sterylnych kleszczy dla każdego innego szczepu bakterii.
- Zebrać pożywkę z używanej studzienki zbiorczej dla każdej wkładki do oddzielnych oznaczonych probówek. Umieść te rurki na lodzie. Pomiędzy punktami czasowymi należy umieścić płytki transwell z powrotem w inkubatorze.
- Dla każdej wkładki połącz zebrane media z t = 0,5 h, t = 1 h, t = 1,5 h i t = 2 h i krótko wiruj. Zebrane podłoża należy umieścić na płytkach agarowych Luria-Bertani (LB) przy użyciu metody rozcieńczania torowego w celu ilościowego określenia ilości bakterii poddanych transcytozji w ciągu pierwszych 2 godzin doświadczenia.
NUTA: Pobieranie bakterii co 30 minut i trzymanie ich na lodzie minimalizuje rozwój bakterii w studzienkach zbiorczych, a pomiary są wykonywane na bakteriach z przewagą transcytozy. - Umieścić oznakowane płytki agarowe LB do rozcieńczania torów w inkubatorze bakteryjnym w temperaturze 37 °C bez dodatkowego CO2 i umieścić płytkę transwell T84 z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych.
- Przy t = 4 h powtórz krok 2.3, łącząc zebrane media z t = 2,5 h, t = 3 h, t = 3,5 h i t = 4 h.
- Przy t = 6 h powtórzyć krok 2.3, łącząc zebrane pożywki z t = 4,5 h, t = 5 h, t = 5,5 h i t = 6 h. Dodatkowo, przy t = 6 h, płytkować media z dołków kontrolnych.
3. Zakończenie eksperymentu
- Zmierz i zapisz przeznabłonkową oporność elektryczną (TEER) na koniec eksperymentu, t = 6 godzin.
- Odkaż sondę, zanurzając ją w 70% etanolu na 10-15 minut. W razie potrzeby wyrzuć wkładki lub zachowaj je/przetwórz do dodatkowych zastosowań. Pozostawić płytki agarowe LB do inkubacji przez noc i zdezynfekować i/lub bezpiecznie usunąć wszystkie inne użyte materiały.
- Po całonocnej inkubacji należy ręcznie policzyć kolonie bakteryjne na płytkach LB do rozcieńczania torów, aby określić ilość inokulum i ilość transcytozy E. coli . Upewnij się, że na płytkach kontrolnych nie widać żadnych bakterii.