Ocena transcytozy E. coli w monowarstwach nabłonka jelitowego

Streszczenie

Źródło: Islam, A. i wsp., Ocena transcytozy jelitowej izolatów bakteriemii Escherichia coli u noworodków. J. Vis. Exp. (2023)

Ten film przedstawia procedurę oceny transcytozy noworodków Escherichia coli w monowarstwach nabłonka jelitowego za pomocą wkładek transwell, pomiaru oporu elektrycznego i kwantyfikacji bakterii.

Protokół

1. Inokulacja komórek (początek eksperymentu)

1. Dokładnie po 2 godzinach wyjąć poranne kultury bakterii z wytrząsarki i odwirować je przez 10 minut (1 900 x g, 4 °C).
   NUTA: W przypadku wszystkich kolejnych kroków utrzymuj wszystkie zawiesiny bakteryjne na lodzie, aby zminimalizować wzrost.
2. Zawiesić osad bakteryjny w pożywce do hodowli tkankowych (TCM) bez antybiotyków. Za pomocą spektrofotometru dostosuj gęstość optyczną (OD) do 0,7-0,9, a następnie rozcieńczyć antybiotykami TCM bez antybiotyków do stężenia 1 x 10⁶ jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml (rozcieńczenie około 1:100). Użyj tej zawiesiny bakteryjnej, aby zainfekować każdą wkładkę 1 x 10⁵ CFU na 100 μl objętości.
3. Oznaczyć płytkę transwell i zainfekować każdą wkładkę 100 μl inokulum dostosowanego do OD (w sumie 1 x 10⁵ CFU na wkładkę). Test właśnie się rozpoczął. Zanotuj czas i zapisz go jako t = 0 h.
4. Zawiesinę bakteryjną inokulum należy umieścić na płytce w celu ilościowego oznaczenia jtk/ml przy użyciu metody rozcieńczania toru, posiażdżając 10 μl podwielokrotności na kwadratowych płytkach agarowych LB.

2. Kwantyfikacja transcytozy

1. Co 30 minut po inokulacji napełniaj nowe studzienki 500 μl TCM bez antybiotyków. Przenieś wkładki do tych nowych studzienek za pomocą innego zestawu sterylnych kleszczy dla każdego innego szczepu bakterii.
2. Zebrać pożywkę z używanej studzienki zbiorczej dla każdej wkładki do oddzielnych oznaczonych probówek. Umieść te rurki na lodzie. Pomiędzy punktami czasowymi należy umieścić płytki transwell z powrotem w inkubatorze.
3. Dla każdej wkładki połącz zebrane media z t = 0,5 h, t = 1 h, t = 1,5 h i t = 2 h i krótko wiruj. Zebrane podłoża należy umieścić na płytkach agarowych Luria-Bertani (LB) przy użyciu metody rozcieńczania torowego w celu ilościowego określenia ilości bakterii poddanych transcytozji w ciągu pierwszych 2 godzin doświadczenia.
   NUTA: Pobieranie bakterii co 30 minut i trzymanie ich na lodzie minimalizuje rozwój bakterii w studzienkach zbiorczych, a pomiary są wykonywane na bakteriach z przewagą transcytozy.
4. Umieścić oznakowane płytki agarowe LB do rozcieńczania torów w inkubatorze bakteryjnym w temperaturze 37 °C bez dodatkowego CO₂ i umieścić płytkę transwell T84 z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych.
5. Przy t = 4 h powtórz krok 2.3, łącząc zebrane media z t = 2,5 h, t = 3 h, t = 3,5 h i t = 4 h.
6. Przy t = 6 h powtórzyć krok 2.3, łącząc zebrane pożywki z t = 4,5 h, t = 5 h, t = 5,5 h i t = 6 h. Dodatkowo, przy t = 6 h, płytkować media z dołków kontrolnych.

3. Zakończenie eksperymentu

1. Zmierz i zapisz przeznabłonkową oporność elektryczną (TEER) na koniec eksperymentu, t = 6 godzin.
2. Odkaż sondę, zanurzając ją w 70% etanolu na 10-15 minut. W razie potrzeby wyrzuć wkładki lub zachowaj je/przetwórz do dodatkowych zastosowań. Pozostawić płytki agarowe LB do inkubacji przez noc i zdezynfekować i/lub bezpiecznie usunąć wszystkie inne użyte materiały.
3. Po całonocnej inkubacji należy ręcznie policzyć kolonie bakteryjne na płytkach LB do rozcieńczania torów, aby określić ilość inokulum i ilość transcytozy E. coli . Upewnij się, że na płytkach kontrolnych nie widać żadnych bakterii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
15 ml sterylnych probówek stożkowych	MidSci	Zobacz materiał C15B
2 ml probówek do mikrowirówek	Avant	AVSS2000
50 ml sterylne probówki stożkowe z polipropylenu	Sokół	352070
Wirówka	Sorvall (Sorvall)	Legenda RT
Jednorazowe pętle do zaszczepiania	Marka rybacka	22363605
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle (DMEM)	Gibco (firma Gibco)	11965-084
Nabłonkowy miernik napięcia / oma	Światowe instrumenty precyzyjne	Silnik EVOM
Wytrząsarka do inkubatora	Nowy Brunszwik	Innova 4080
Inkubatory	Thermo Scientific	51030284	Trzy z nich są stosowane w tej metodzie: jeden do sterylnej hodowli tkanek, jeden do hodowli zakażonych tkanek i jeden do inkubacji bakterii.
Rosół lizogeniczny	Firma Difco	244610
Agar z bulionu lizogennego	IBI Naukowy	IB49101
Spektrofotometr	Unico	1100RS powiedział:
Komórki jelitowe T84	Amerykańska Kolekcja Kultur Tkankowych	Zobacz materiał CCL248
Wkładki do hodowli tkankowych, z membraną z politylenu treftalanu, pory 3 μm, format 24 dołków	Sokół	353096
Płytka do hodowli tkankowej, 24 dołki	Sokół	353504