Wykrywanie docelowego analitu za pomocą biosensora bakteryjnego

Streszczenie

Źródło: Barber, A. E., et al. Przygotowanie i zastosowanie nowego biosensora bakteryjnego do przypuszczalnego wykrywania pozostałości po postrzałach z broni palnej. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film pokazuje wykrywanie określonych analitów za pomocą biosensora bakteryjnego. Pobiera się kulturę bakteryjną zawierającą plazmid z genem białka czerwonej fluorescencji (RFP) pod promotorem wrażliwym na analit. Po dokładnym wytarciu powierzchni testowej niewielką część chusteczki zanurza się w kulturze i inkubuje. Interakcja analitu z promotorem aktywuje ekspresję RFP, potwierdzając obecność docelowego analitu.

Protokół

UWAGA: Przedstawiono syntezę białka czerwonej fluorescencji E. coli (RFP).

1. Przygotowanie plazmidowego kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) z E. coli

1. Rozmrozić E. coli zawierającą plazmid z genem RFP i genem oporności na ampicylinę, a następnie wyhodować E. coli na płytkach agarowych Luria Bulth (LB) zawierających 100 μg/ml ampicyliny w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Na przykład użyj plazmidu J10060 z rejestru standardowych części biologicznych używanych w biologii syntetycznej (patrz tabela materiałów). Plazmid J10060 zawiera gen RFP pod kontrolą regionu promotora pBad i gen oporności na ampicylinę. Alternatywnie, przekształcić E. coli (patrz krok 3.2) za pomocą plazmidu przed wzrostem na płytkach agarowych LB.
2. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem miniprep (patrz tabela materiałów), aby wyizolować DNA z 1 ml kultury E. coli , która zawiera plazmid J10060. Celem poniższego protokołu jest usunięcie promotora pBad i zastąpienie go pożądanym promotorem dla urządzenia.
3. Po miniprzygotowaniu plazmidu przechowuj DNA w zamrażarce, aż będzie gotowe do trawienia.

2. Trawienie enzymatyczne restrykcyjne

1. Przygotuj następującą reakcję w probówce mikrowirówkowej do mineralizacji EcoRI i NheI: 10 μl plazmidowego DNA J10060 (wyizolowanego w kroku 1), 8 μl wody i po 1 μl enzymów EcoRI i NheI wstępnie zmieszanych z 1 μl buforu (patrz tabela materiałów).
2. W przypadku DNA promotora należy przeprowadzić następującą reakcję w probówce mikrowirówkowej do trawienia EcoRI i NheI: 10 μl wyżarzonych sekwencji DNA promotora (8 μl wody i po 1 μl enzymów EcoRI i NheI wstępnie zmieszanych z 1 μl buforu.
   1. W przypadku antymonu (Sb-), ołowiu (Pb-) lub trinitrotoluenu (TNT)-RFP (patrz tabela materiałów) rozpuścić oligonukleotydy w buforze (30 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), pH 7,5; 100 mM octanu potasu), inkubować w równych stężeniach molowych, ogrzewać do 94 °C przez 2 minuty i stopniowo schładzać w temperaturze pokojowej).
3. Wymieszać próbki, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety ustawionej na 10 μl.
4. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
5. Enzymy należy dezaktywować termicznie w temperaturze 80 °C przez 5 minut.
6. Przechowuj strawione DNA w zamrażarce, aż będzie gotowe do następnego kroku.

3. Podwiązanie i transformacja

1. Ligacji
   1. Używając plazmidu i promotora DNA, które zostały podwójnie strawione za pomocą EcoRI i NheI w kroku 2, ustawić mieszaninę reakcyjną pokazaną w tabeli 1 w probówce mikrowirówkowej na lodzie; dodaj ligazę DNA T4 na końcu. UWAGA: Tabela 1 przedstawia ligację przy użyciu stosunku molowego wektora 1:3 do wstawienia dla wskazanych rozmiarów DNA.
   2. Delikatnie wymieszać reakcję, pipetując w górę i w dół, a następnie krótko odwirować.
   3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   4. Dezaktywować termicznie w temperaturze 65 °C przez 10 min.
2. Przekształcenie
   1. Rozmrozić probówkę z 20 μl komórek E. coli kompetentnych DH5-alfa na lodzie, aż znikną ostatnie kryształki lodu.
   2. Dodać 5 μl plazmidowego DNA do mieszaniny komórek. Ostrożnie przesuń probówkę 4-5 razy, aby wymieszać komórki i DNA.
   3. Umieść mieszaninę na lodzie na 2 minuty.
   4. Szok termiczny dokładnie o temperaturze 42 °C przez dokładnie 30 s. Nie mieszać.
   5. Ułóż na lodzie na 2 min. Nie mieszać.
   6. Odpipetować 380 μl super optymalnego bulionu o temperaturze pokojowej z represją katabolitu (SOC) do mieszaniny. Natychmiast rozprowadzić na płytce agarowej LB zawierającej ampicylinę (100 μg/ml) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
   7. Sprawdź płytki w ciągu 24 godzin pod kątem wzrostu.
   8. Uszczelnij płytki folią uszczelniającą i przechowuj je w lodówce, aż będą gotowe do następnego kroku.

4. Reakcja łańcuchowa polimerazy kolonii (PCR)

1. Dodać do probówki do PCR (ustawić 4 probówki reakcyjne) mieszaniny reakcyjne pokazane w tabeli 2.
2. Delikatnie wymieszaj reakcje, pipetując w górę i w dół.
3. Za pomocą żółtej końcówki pipety zeskrob kolonię (lub bardzo mały obszar) przekształconej E. coli. Przenieś przeciągnięcie tej E. coli na nową płytkę LB/ampicyliny/agaru, która została odcięta, a następnie włóż końcówkę pipety do probówki do PCR. Potrząśnij końcówką pipety, aby wymieszać E. coli z mieszanką PCR. Powtórz jeszcze trzy razy, aby uzyskać dodatkowe kolonie. Przenieś probówki PCR do maszyny do PCR i rozpocznij termocykl za pomocą programu pokazanego w Tabeli 3.
4. Przeprowadź elektroforezę żelową przy użyciu 2% żelu agarozowego w TAE 9Tris-Acetate-EDTA), aby określić, które kolonie mają najlepszą ligację do plazmidu i wyhodować te kolonie na nowej płytce.
5. Przechowuj płytki w lodówce, aż będą gotowe do testowania. Przygotuj płynną kulturę w bulionie Luria z dodatkiem 100 μg/ml ampicyliny do testów chemicznych.

5. Sekwencjonowanie DNA

1. Do każdej próbki dodaj 5 μl plazmidu, 4 μl startera sekwencjonującego i 3 μl wody dejonizowanej.
2. Umieść tę mieszaninę w probówce i wyślij ją do sekwencjonowania DNA (patrz Tabela materiałów).
3. Analizuj dane sekwencji DNA, aby porównać oczekiwane i obserwowane sekwencje DNA za pomocą oprogramowania do analizy sekwencji DNA, aby upewnić się, że nie ma mutacji i że geny zostały prawidłowo wstawione.
   UWAGA: Użycie E. coli jako czujnika chemicznego przedstawiono poniżej.

6. Przygotowanie kultur bakterii E. coli

1. Przygotować LB ze 100 μg/ml ampicyliny do płynnych kultur.
2. Przygotuj płynne kultury bakterii czujnika, bakterii kontroli dodatniej* i bakterii kontroli ujemnej**.
   UWAGA: *Bakterie kontroli pozytywnej: E. coli zawierająca plazmid z genem RFP pod kontrolą konstytutywnego promotora; W pracy wykorzystano plazmid E1010 z rejestru standardowych części biologicznych stosowanych w biologii syntetycznej (patrz tabela materiałów).**Bakterie kontroli negatywnej: E. coli zawierające plazmid z genem RFP pod kontrolą innego promotora, takiego jak promotor pBad (plazmid J10060 z rejestru standardowych części biologicznych stosowanych w biologii syntetycznej (patrz tabela materiałów) lub plazmid, który nie ma genu RFP.
3. Umieścić kultury w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 220 obr./min na minimum 8 godzin, a maksymalnie 18 godzin. Mętny bulion wskazuje na rozwój bakterii.

7. Miareczkowanie E. coli w celu sprawdzenia działania urządzenia

UWAGA: Po miareczkowaniu czujników w celu sprawdzenia działania tego kroku nie trzeba powtarzać. Kontrola pozytywna w postaci dodania ołowiu, antymonu i 2,4-DNT lub 1,3-dinitrobenzenu (1,3-DNB) może sprawdzić działanie urządzeń dla każdego zastosowania bez konieczności pełnego miareczkowania.

1. Przygotować roztwór podstawowy analitu (analitów) o stężeniu 10 ppm w wodzie. Jeśli problemem jest rozpuszczalność, użyj mieszaniny wody i metanolu w proporcji 50/50.
2. Korzystając z tabeli 4 jako przewodnika, oznacz odpowiednią liczbę sterylnych probówek hodowlanych i umieść 2 ml bulionu hodowlanego (z kroku 6 protokołu) w każdej probówce.
   UWAGA: W celu wyznaczenia ogólnego zakresu analitycznego należy wykonać co najmniej trzy różne poziomy analitu z bakteriami czujnikowymi, jeden poziom z kontrolą ujemną i jeden poziom z kontrolą dodatnią. Powinna być również jedna tubka każdej z bakterii, która nie zawiera dodatku metalu (inny rodzaj kontroli negatywnej). Aby dokładniej określić zakres analityczny i granice wykrywalności, należy użyć większego zakresu stężeń analitu.
3. Dodać roztwór podstawowy analitu do probówek zawierających 2 ml bulionu, jak podano w Tabeli 4, umieścić zatrzaski na probówce hodowlanej tak, aby były luźne (aby umożliwić przepływ powietrza do probówki) i przekręcić rurkę hodowlaną.
4. Pozostawić zatrzaski luźno na probówkach hodowlanych i umieścić je w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 220 obr./min i temperaturze 37 °C na co najmniej 24 godziny.
5. Wyjmij probówki z inkubatora, mocno zatrzaśnij nakrętki na probówkach i przechowuj probówki w lodówce, aż będą gotowe do analizy fluorescencyjnej.

8. Wykorzystanie E. coli jako czujnika chemicznego pozostałości po śrutach (GSR)

1. Za pomocą chusteczki na bazie etanolu przeznaczonej do usuwania ołowiu (patrz Tabela materiałów) wytrzyj wszystkie powierzchnie dłoni, w tym między palcami. Użyj osobnej chusteczki do każdej ręki. Chusteczki należy przechowywać w odpowiednio oznakowanej, zamykanej torbie do czasu analizy.
2. W przypadku powierzchni, które mają być badane, użyj chusteczki na bazie alkoholu w przypadku dużych powierzchni lub wacika zwilżonego etanolem w przypadku małych powierzchni.
   UWAGA: Aby zademonstrować reakcję czujników na GSR, wnętrze zużytej łuski naboju kalibru .40 przetarto wacikiem zwilżonym etanolem.
3. Zakładając czyste rękawice i używając nożyczek oczyszczonych alkoholem, wytnij około 1^cm2 odcinek ze środka chusteczki.
4. Umieść odcięty kawałek chusteczki do rąk lub bawełnianego wacika bezpośrednio w probówce hodowlanej, która zawiera 2 ml bakterii czujnika, upewniając się, że jest zanurzona w bulionie.
5. Postępuj zgodnie z powyższym opisem w krokach 7.4 – 7.5.

Tabela 1. Mieszanina reakcyjna do podwiązania, krok protokołu 3.1.1.

SKŁADNIK	20 μL REAKCJA
10X bufor ligazy DNA T4	2 μl
Plazmidowe DNA (3 kb)	3 μL
Promotor DNA (0,7 kb)	10 μL
Woda wolna od nukleaz	4 μl
Ligaza DNA T4	1 μL

 

 

 

 

 

 

Tabela 2. Mieszaniny reakcyjne do PCR kolonii, krok protokołu 4.1.

Składnik	25 μL reakcji
Podkład 10 μM do przodu	0,5 μL
10 μM Podkład odwrotny	0,5 μL
JedenTaq 2X Master Mix	12,5 μl
Woda wolna od nukleaz	11 μL

 

 

 

 

 

Tabela 3. Parametry termocyklingu PCR dla kroku 4.3 protokołu.

KROK	Najwyższa temp	GODZINA
Początkowa denaturacja	94 °C	30 sekund
30 cykli	94 °C	30 sekund
	55 °C	45 sekund
	68 °C	Czas trwania: 60 s
Końcowe przedłużenie	68 °C	Czas trwania: 5 min
Trzymać	4 °C

 

 

 

 

 

 

 

Tabela 4. Ogólne doświadczenie przygotowane do miareczkowania bioczujników, krok 7.2 protokołu.

Identyfikator rury	Bakteria	Stężenie dodanego roztworu analitu (ppm)	Dodano metal	Objętość roztworu analitu dodana do 2 000 μl bulionu	[analit], ppb
1	Zapytanie ofertowe PbRFP	10	Pb	2.5	12
2	Zapytanie ofertowe PbRFP	10	Pb	75	361
3	Zapytanie ofertowe PbRFP	10	Pb	150	698
4	Zapytanie ofertowe PbRFP	0	żaden	0	0
5	Zapytanie ofertowe neg	10	Pb	10	50
6	Zapytanie ofertowe POS	10	Pb	10	50

Materiały