Wykrywanie docelowego analitu za pomocą biosensora bakteryjnego

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Barber, A. E., et al. Przygotowanie i zastosowanie nowego biosensora bakteryjnego do przypuszczalnego wykrywania pozostałości po postrzałach z broni palnej. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film pokazuje wykrywanie określonych analitów za pomocą biosensora bakteryjnego. Pobiera się kulturę bakteryjną zawierającą plazmid z genem białka czerwonej fluorescencji (RFP) pod promotorem wrażliwym na analit. Po dokładnym wytarciu powierzchni testowej niewielką część chusteczki zanurza się w kulturze i inkubuje. Interakcja analitu z promotorem aktywuje ekspresję RFP, potwierdzając obecność docelowego analitu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przedstawiono syntezę białka czerwonej fluorescencji E. coli (RFP).

1. Przygotowanie plazmidowego kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) z E. coli

Rozmrozić E. coli zawierającą plazmid z genem RFP i genem oporności na ampicylinę, a następnie wyhodować E. coli na płytkach agarowych Luria Bulth (LB) zawierających 100 μg/ml ampicyliny w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Na przykład użyj plazmidu J10060 z rejestru standardowych części biologicznych używanych w biologii syntetycznej (patrz tabela materiałów). Plazmid J10060 zawiera gen RFP pod kontrolą regionu promotora pBad ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,3-dinitrobenzen, 97%	Aldrich	D194255-25G
2,4-dinitrotoluen, 97%	Aldrich	Numer katalogowy: 101397-5G
Agar	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP1423-500
Ampicyliny	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP1760-5
Antymon, referencyjny roztwór wzorcowy (1000 ppm ±1%/certyfikowany)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał SA450-100	Wzorzec w rozcieńczonym HNO₃
Wytnij inteligentny bufor	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał B7204S
Bufor dupleksowy	Zintegrowane technologie DNA	11-01-03-00
Enzym restrykcyjny EcoRI-HF	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Czynnik chłodniczy R3101S
Etanol klasy HPLC, denaturowany	Acros Organics	AC611050040	Rozpuszczalniki nie muszą być klasy HPLC, ACS lub klasy odczynnikowej będą działać.
Zestawy do sekwencjonowania DNA Eurofins Genomics SimpleSeq	Eurofins Genomics	Zestaw SimpleSeq Standard
Starter do przodu do PCR kolonii	Zintegrowane technologie DNA		5'- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3'
Starter do sekwencjonowania DNA	Zintegrowane technologie DNA		5'- GTAAAACGACGGCCAGTG-3'
IBI Science Mini-zestaw plazmidu o dużej prędkości	IBI Naukowy	IB47101
LB bulion, młynarz	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP1426-500
Ołów, referencyjny roztwór wzorcowy (1000 ppm ±1%/certyfikowany)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał SL21-100	Wzorzec w rozcieńczonym HNO3
Jednorazowe chusteczki do czyszczenia i dekonowania LeadOff	Produkt leczniczy	45NRCN	Sprzedawane w kanistrach lub pakowane pojedynczo, każda chusteczka na bazie alkoholu będzie działać.
Metanol klasy HPLC	Fisher Naukowy	A452-4	Rozpuszczalniki nie muszą być klasy HPLC, ACS lub klasy odczynnikowej będą działać.
NEB 5-alfa Kompetentne komórki E. coli	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał C2987I
Enzym restrykcyjny NheI-HF	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Czynnik chłodniczy R3131S
Woda wolna od nukleaz	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał B1500S
OneTaq 2X Master Mix z buforem standardowym	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał M0482S
Plazmidy z rejestru standardowych części biologicznych stosowanych w biologii syntetycznej	Rejestr Standardowych Części Biologicznych		http://parts.igem.org/Main_Page
Sekwencje promotorów	Zintegrowane technologie DNA		Promotor Sb: 5'-GCATGAATTCAGTCATATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAGAGACACTACCTGCAACAATCGGCTAGCGCAT-3' 3' 3'-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAAAAACTGAATAGGCGAAGCTTCTCTCTGTGATGGACGTTGTTGTTGTGGGGTA-5'Pb promotor: 5'-GCATGAATTCGTCTTGACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCAACGCGAGCTAGCGCAT-3' 3'-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATCATTGATCTCCCACATCTCCCCCATCCCCTGCGTA-5' promotor TNT: 5' GCATTCTAGATCAATTTATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCACATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAATCACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3' 3'CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTAATTAACTTAAGCGTA5'
Odwrócony starter do PCR kolonii	Zintegrowane technologie DNA		5'- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3'
Odwrotny starter do sekwencjonowania DNA	Zintegrowane technologie DNA		5'- GGAAACAGCTATGACCATG-3'
Ligaza DNA T4	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał M0202S

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Powiązane artykuły