Test roju do wizualizacji ruchliwości powierzchni bakterii

Streszczenie

Źródło: Morales-Soto, N. i wsp., Przygotowanie, obrazowanie i kwantyfikacja testów ruchliwości powierzchni bakterii. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film przedstawia test roju z wykorzystaniem bakterii, które wyrażają zielone białko fluorescencyjne, w celu obserwacji ruchliwości powierzchni na miękkim agarze. Obrazowanie poklatkowe rejestruje skoordynowaną ekspansję i tworzenie wąsów, podkreślając ruchliwość powierzchni bakterii.

Protokół

1. Przygotowanie pożywki do oznaczania roju i inokulacja

1. Przygotowanie nośnika
   NUTA: Opisany poniżej skład pożywki ma zastosowanie do badań nad tworzeniem się wąsów Pseudomonas aeruginosa . Proszę zapoznać się ze specyfikacjami pożywek w Tabeli 1 dla testów ruchliwości powierzchni Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis i Myxococcus xanthus .
   1. Wymieszać 200 ml fluidalnego bioreaktora tlenowego (FAB)-minus siarczan amonu ((NH4)₂SO₄) pożywki rojowej (tabela materiałów), 0,9 g agaru szlachetnego i 0,2 g kwasów Casamino (tabela 1), mieszając z mieszadłem magnetycznym. Używaj małych objętości (100-300 ml), aby poprawić spójność między eksperymentami.
   2. Autoklawować mieszaninę agaru i pożywki o pojemności 200 ml, stosując czas ekspozycji 22 minuty, temperaturę ekspozycji 121,1 °C i opcję szybkiego odpowietrzania. Ustawienia autoklawu pozwolą na prawidłową sterylizację i stopienie agaru, ale zapobiegną karmelizacji agaru.
      NUTA: Szlachetny agar jest podatny na karmelizację; Ruchliwość bakterii jest zmieniona na karmelizowanym agarze .
   3. Natychmiast po zakończeniu cyklu sterylizacji zamknij nakrętkę butelki z pożywką, aby zapobiec utracie wody przez parowanie. Należy jednak pamiętać, że szczelne zakrętki mogą powodować efekt podobny do "zamykania próżniowego" na butelce.
   4. Schłodzić podłoże do temperatury 50 °C, mieszając w temperaturze pokojowej (RT) i dodać 2 ml sterylnego 1,2 M glukozy. Alternatywnie, umieścić pożywkę w inkubatorze lub łaźni wodnej w temperaturze 60 °C do momentu, gdy będzie gotowa do użycia (do 15 godzin później) i postępować zgodnie ze wskazaniami. Aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w pożywce, dokładnie wymieszaj za pomocą mieszadła magnetycznego; Bąbelki na powierzchni agaru zapobiegną równomiernemu rojeniu.
      NUTA: W przypadku innych testów, w razie potrzeby, dodaj składniki wrażliwe na ciepło, których nie można sterylizować w autoklawie, takie jak dodatkowe składniki odżywcze lub barwniki (np. 8 μl barwnika Invitrogen Syto 63 na 100 ml stopionego agaru w celu zobrazowania M. xanthus, jak pokazano w reprezentatywnych wynikach poniżej). Dodanie niektórych barwników może wpływać na wyjściowe zachowanie roju, które należy sprawdzić w porównaniu z kontrolą bez barwnika.
   5. W okapie laboratoryjnym podamy 7,5 ml sterylnego podłoża na polistyrenową szalkę Petriego o średnicy 60 mm i utrzymywać płytki w jednej warstwie (nie ułożone w stos). W celu uzyskania większej powierzchni roju należy dodać 25 ml pożywki na szalkę Petriego o średnicy 100 mm. Ważne jest, aby napełniać naczynia na równej poziomej powierzchni. Użyj poziomicy w kształcie tarczy, aby sprawdzić, czy powierzchnia jest wyrównana.
      NUTA: W przypadku testów na P. aeruginosa użycie określonej objętości pożywki na płytkę poprawi spójność i odtwarzalność. W przypadku testów B. subtilis i M. xanthus nalewanie ręczne daje wyniki porównywalne z podwielokrotnościami objętości właściwej.
2. Utwardzanie płyt
   1. W przypadku małych płytek (60 mm) pozostawić stopione podłoże agarowe do utwardzenia (zarówno ustawione na półstałe, jak i suchy nadmiar płynu) w okapie bez przykrycia (tj. bez pokrywek) przez 30 minut. Większe płytki (100 mm) wymagają dłuższego czasu utwardzania (patrz Dyskusja).
      NUTA: Alternatywnie, niektóre testy mogą wymagać utwardzania płytek na blacie stołu przez noc (20-24 godziny) przykrytych (tj. z pokrywkami) w jednej warstwie (Tabela 1). Rój jest wrażliwy zarówno na nadmiar, jak i nieodpowiednią wilgotność. Wilgotność, przepływ powietrza i temperatura w danym laboratorium mogą wymagać zmian w utwardzaniu płytki, aby zapewnić optymalne rojenie się bakterii.
   2. Zaszczepić płytki natychmiast po zakończeniu okresu suszenia. Nie przechowuj płytek do dalszego użytku.
      1. Wykonaj "test rozprzestrzeniania się atramentu", nakrapiając płytkę testową mieszaniną 10 μl wodoodpornego czarnego indyjskiego atramentu Higginsa o stężeniu 0,50% (obj. / obj.) i inokulum bakteryjnego. Jeśli mieszanina tuszu i inokulum łatwo się rozprowadza (tj. nie zachowuje postaci kropel) na powierzchni podłoża, pożywka będzie potrzebowała dodatkowego czasu na wyschnięcie.
         NUTA: W przypadku gatunków, które są szczególnie wrażliwe na wilgoć (np. P. aeruginosa), należy przeprowadzić szybki "test rozprowadzania atramentu", aby określić, czy płytki są wystarczająco suche.
3. Inokulacja testem roju
   1. Zaszczepić 6 ml pożywki bulionowej (szczegóły w Tabeli 1 ) wyizolowaną kolonią ze świeżej (< 5-dniowej hodowli bulionu lizogenicznego (LB) na płytce. Kultury bulionowe inkubować przez noc (≤18 godz.) w temperaturze 30 °C lub 37 °C z wytrząsaniem poziomym (240 obr./min).
   2. Zaszczepić płytki roju przez plamienie 1-5 μl nocnej kultury bulionowej lub przez "szturchanie" agaru sterylną wykałaczką lub drucianą igłą do zaszczepiania.
      NUTA: Preferujemy tę drugą metodę, ponieważ zmniejsza ona prawdopodobieństwo rozpryskiwania inokulum i zapobiega dodawaniu dodatkowej wilgoci do powierzchni roju.
4. Inkubacja testu roju
   1. W przypadku testu ogólnego inkubować płytki testowe roju w temperaturze 30 °C lub 37 °C (lub nawet 42 °C w przypadku B. subtilis; Tabela 1) — jest to specyficzne dla bakterii. Podczas inkubacji odwróć płytki, aby nadmiar wilgoci skondensował się na pokrywce, a nie na agarze .
      NUTA: Temperatura może wpływać na fenotyp i kinetykę. W przypadku rojów P. aeruginosa inkubacja w temperaturze 37 °C prowadzi do szybszego wzrostu i ekspansji roju niż inkubacja w temperaturze 30 °C; Jednak morfologia tych rojów często różni się wraz z tą zmianą temperatury.
   2. W przypadku obrazowania poklatkowego należy inkubować płytki roju w odpowiedniej temperaturze przed przeniesieniem ich do stacji obrazowania (szczegóły w Tabeli 1 ).
      NUTA: Ta inkubacja przed obrazowaniem pozwala rojom rozpocząć rozwój i zadomowić się przed przeniesieniem do nowego środowiska, które może, ale nie musi być optymalne dla ruchliwości roju.

2. Obrazowanie makroskopowe testów ruchliwości powierzchni

1. W przypadku obrazowania poklatkowego, po okresie inkubacji przed obrazowaniem, umieść płytki testowe roju na przezroczystej płytce obrazowej wewnątrz komercyjnej stacji obrazowania in vivo . Obraz do sześciu płyt o średnicy 60 mm lub czterech płyt o średnicy 100 mm jednocześnie. Ponieważ kamera rejestruje obrazy spod płaszczyzny obrazowania, należy odwrócić płytki, aby ścieżka optyczna nie była zasłonięta. Alternatywnie, inkubować w temperaturze 30 °C lub 37 °C (tabela 1) przez czas trwania doświadczenia i wyjmować z inkubatora płytki do obrazowania w ustalonych odstępach czasu.
2. Umieść pokrywki szalek Petriego pionowo na wierzchu talerza, na którym znajdują się zaszczepione pożywki. Napełnij pokrywki szalek Petriego wodą, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu podczas obrazowania, i zamknij cały zestaw za pomocą innej przezroczystej tacy, aby utrzymać wilgotność przez cały czas trwania eksperymentu.
3. Korzystając z oprogramowania do obrazowania molekularnego (MI), uruchom test (testy) w temperaturze pokojowej, korzystając z ustawień obrazowania opisanych w Tabeli 2. W przypadku obrazowania poklatkowego skonfiguruj protokół z niezbędnymi krokami i specyfikacjami.

Tabela 1: Specyfikacje dotyczące przygotowania do oznaczania ruchliwości powierzchni. Zawiera specyfikacje przygotowania do testu ruchliwości powierzchni dla P. aeruginosa, B. subtilis i M. xanthus.

	P. aeruginosa (P. aeruginosa)	Badania nad powstawaniem wąsów P. aeruginosa	B. subtilis	M. xanthus (M. xanthus)
Nocne pożywki do hodowli bulionu	FAB plus 30 mM glukozy	FAB plus 30 mM glukozy	FUNT	CTT (media złożone)
Temperatura inkubacji kultur bulionowych przez noc	37 °C	37 °C	37 °C	30 godzin w 30 °C
Nośniki roju	FAB	FAB minus (NH4)2SO4	2% (wag./obj.) LB	CTT
Media rojowe: dodatkowe komponenty	12 mMglukozy a	10% (wt/vol) Casaminokwasy (CAA), 12 mMGlukoza a	N/a	SYTO® 64a
Rodzaj agaru	Agar, Szlachcic	Agar, Szlachcic	Agar granulowany	Agar, Szlachetny Affymetrix
Stężenie agaru (wag./obj.)	0.45%	0.45%	0.60%	1.50%
Rozmiar płyty roju	60 mm	60 mm	Szerokość 100 mm	150 mm
Objętość nośnika na płytę	Pojemność 7,5 ml	Pojemność 7,5 ml	Ręcznie nalewane	Ręcznie nalewane
Ustawianie/metoda suszenia roju	Kaptur; odsłonięte talerze	Kaptur; odsłonięte talerze	Zakryte płyty stołowe	Zakryte płyty stołowe
Ustawienie roju/czas schnięcia roju	Czas trwania: 30 min	Czas trwania: 30 min	Nocleg (20 -24 godzin)	Nocleg (20 -24 godzin)
Temperatura inkubacji testu roju	30 lub 37 °C	30 °C	37 °C	30 °C
Inkubacja do obrazowania poklatkowego	30 °C przez co najmniej 4 godziny	30 °C przez co najmniej 4 godziny	37 °C przez 2 godziny	RT przez 12 godzin
Długość ujęcia poklatkowego	24 godziny	24 godziny	10 godz	66 godz
Ustawienie poklatkowe	1 klatka/10 min	1 klatka/10 min	1 klatka/6 min	1 klatka/10 min
a Dodano po sterylizacji w autoklawie.

 

Tabela 2: Specyfikacja obrazowania. Specyfikacja stacji obrazowania Bruker do obrazowania czerwonej i zielonej fluorescencji oraz luminescencji wzrostu powierzchni bakterii.

Sygnał	Zielona fluorescencja	Czerwona fluorescencja I	Czerwona fluorescencja II	Luminescencja
Białko lub barwnik	Białko zielonej fluorescencji (GFP)	mBiałko wiśni lub barwnik ramnolipidowy czerwieni nilowej	SYTO® 64	Lucyferazy z operonu luksu
Długość fali wzbudzenia (nm)	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	Od
Długość fali emisji (nm)	535 ± 17.5	600 ± 17.5	670 ± 17.5	Brak filtra
Czas naświetlania (s)	30	60	60	240
Funkcja przysłony	4.0	4.0	2.5	1.1
Pole widzenia (mm)	190	190	140	120
Płaszczyzna ogniskowa (mm)	27.5	27.5	12.2	4
Grupowanie (piksele)	Żaden	2 x 2	Żaden	8 x 8

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki:
Minimalny nośnik FAB:				Przygotuj się co ~4 tygodnie. Uzupełnij do 1 l za pomocą nanoczystego H2O.
(NH4)cyfra arabskaTAK4	Sigma	Nr kat. A4418	2 gramów	Nie stosowany w badaniach tworzenia wąsów P. aeruginosa.
Na2HPO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S9390 powiedział:	9 gramów
KH2PO4	Sigma	Zobacz materiał P5655 powiedział:	3 gramów
Zawartość NaCl	BDH (Międzynarodowa Organizacja T	BDH8014	3 gramów
MgCl2 x 6H2O roztwór (198 g/L)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał M33	Pojemność 1 ml
CaCl2 x roztwór 2H2O (14 g/L)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał C79	Pojemność 1 ml
Roztwór metalu śladowego (patrz poniżej)	N/a	N/a	Pojemność 1 ml
Roztwór metalu śladowego:				Uzupełnić do 1 l nanoczystymH2O. Przechowywać w szklanej butelce, mieszając i przykryć folią.
CaSO4 x 2H2O	Sigma-Aldrich	255548	200 mg tabletki powlekania
MnSO4 x H2O	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M7634	20 mg tabletki powlekania
CuSO4 x 5H2O	Fisher Naukowy	Zobacz materiał C493	20 mg tabletki powlekania
ZnSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Z4750 powiedział:	20 mg tabletki powlekania
CoSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C6768	10 mg tabletki powlekania
NaMoO4 x 2H2O	Sigma	Zobacz materiał S6646	10 mg tabletki powlekania
H3BO3	Fisher Naukowy	Ciągnik siodłowy A74	5 mg tabletki powlekania
FeSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał F7002	200 mg tabletki powlekania
Nośniki CTT:				Przygotuj się w razie potrzeby. Uzupełnić do 100 ml nanoczystymH2O.
Tris-HCl, 1 M roztwór (dostosować do pH 8,0)	Amresco (angielski)	234	Pojemność 1 ml	Przygotować 1 M roztwór podstawowy w nano czystymH2O. Doprowadzić pH do 8,0 i wysterylizować filtrem (pory 0,2 μm).
K2HPO4, 1 M roztwór (dostosować do pH 7,6)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P3786	Pojemność 0,1 ml	Przygotować 1 M roztwór podstawowy w nano czystymH2O. Doprowadzić pH do 7,6 i wysterylizować filtrem (pory 0,2 μm).
Roztwór MgSO4	Fisher Naukowy	Zobacz materiał M65	Pojemność 0,8 ml	Przygotować 1 M roztwór podstawowy w nano czystymH2O. Filtr sterylizować (pory 0,2 μm).
Casitone	Diagnostyka BD	225930	1 gramów
Dodatkowe odczynniki:
Rosół LB, Lennox	Diagnostyka BD	240230	2 % (wag./obj.)
D-(+)-glukoza	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G5767	30 mM dla nocnych kultur bulionowych; 12 mM dla nośników roju	Przygotować 1,2 M wysterylizowany roztwór podstawowy z filtrem w nano czystymH2O. Dodać do podłoża po autoklawowaniu.
Aminokwasy (CAA)	Amresco (angielski)	Zobacz materiał J851	0.10 % (wag./obj.)	Zalecany do badań nad powstawaniem wąsów P. aeruginosa. Dodaj do podłoża przed autoklawowaniem.
Agar, Szlachcic	Sigma-Aldrich	Nr kat. A5431	0.45 % (wag./obj.)	Preferowany agar szlachetny do badań ruchliwości powierzchni P. aeruginosa . Dodaj do podłoża przed autoklawowaniem.
Agar, Szlachcic	Affymetrix	10907	1,50 % (wag./obj.)	Stosowany w badaniach ruchliwości powierzchni M. xanthus . Nie zaleca się wykonywania badań ruchliwości P. aeruginosa. Dodaj do podłoża przed autoklawowaniem.
Agar granulowany	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP1423	0.60 % (wag./obj.)
Wodoodporny atrament indyjski Higgins	Higgins	HIG44201	0,50 % (obj. / obj.)	Wymieszaj atrament z inokulum, aby przetestować wilgotność powierzchni roju mediów.
SYTO® 64 czerwone fluorescencyjne barwienie kwasem nukleinowym	Invitrogen	S-11346		Użyć 4 μl (dla P. aeruginosa) lub 8 μl (dla M. xanthus) SYTO® 64 na 100 ml stopionego agaru (dodanego po autoklawowaniu).
Odpowiednie materiały i sprzęt:
szalka Petriego, sterylna, 150 mm x 15 mm (śr. x wys.)	Firma VWR	25384-326
szalka Petriego, sterylna, 100 mm x 15 mm (śr. x wys.)	Firma VWR	25384-342
szalka Petriego, sterylna, 60 mm x 15 mm (śr. x wys.)	Firma VWR	25384-092
Technologia Xtream in vivo	Bruker			Służy do makroskopowego obrazowania badań ruchliwości powierzchni. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html