Mikroskopia z kontrastem fazowym do oceny mutantów rozwojowych u Streptomyces

Abstract

Źródło: Bennett, J. A. i wsp. Wizualna i mikroskopowa ocena mutantów rozwojowych Streptomyces . J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje zastosowanie mikroskopii z kontrastem fazowym do badania różnic fenotypowych między dzikim a zmutowanym Streptomyces coelicolor. Przedstawiono w nim etapy związane z przygotowaniem i obrazowaniem włókien powietrznych w celu wykrycia wad rozwojowych w tworzeniu zarodników.

Protocol

1. Wykonaj mikroskopię z kontrastem fazowym

1. Wysterylizuj pęsetę, myjąc ją w 70% etanolu, a następnie przechodząc przez płomień palnika Bunsena w celu odparowania etanolu. Pozostawić do ostygnięcia.
2. Sterylizuj szkiełka nakrywkowe, myjąc je w 70% etanolu, a następnie pozwalając im wyschnąć na sterylnej szalce Petriego.
3. Przygotować szkiełko nakrywkowe z narośli bakterii, które mają być zbadane.
   1. Podnieś sterylne szkiełko nakrywkowe sterylną pęsetą i umieść szkiełko nakrywkowe na płytce agarowej z mąki mannitolowej sojowej (MS), gdzie bakterie Streptomyces coelicolor są gęste. Delikatnie dociśnij tył szkiełka nakrywkowego pęsetą, aby zapewnić wystarczający transfer zarodników bakterii i grzybni powietrznej.
4. Podnieś szkiełko nakrywkowe z płytki i umieść je tak, aby strona z materiałem komórkowym była skierowana w stronę powierzchni szkiełka mikroskopowego, z 15 μl kropli 50% glicerolu przygotowanej w wodzie do montażu. Zmniejsz ilość pęcherzyków powietrza, umieszczając szkiełko nakrywkowe pod kątem 45° do szkiełka i pozwalając mu opaść na 50% glicerolu.
5. (Opcjonalnie) Uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci w celu konserwacji szkiełka.
6. Wykonaj mikroskopię z kontrastem fazowym w różnych odstępach czasu podczas cykli życia.
   NUTA: Wielokrotne obrazowanie pozwala na pełniejszą analizę i możliwość wykrycia opóźnień w rozwoju. Niezależne powtórzenie obserwacji w celu zapewnienia dokładności i odtwarzalności.
   1. Umieść przygotowane szkiełko na stoliku mikroskopu i dodaj kroplę olejku immersyjnego na środek szkiełka nakrywkowego. Obróć obiektyw fazowy 100X na miejsce i ustaw wieżyczkę skraplacza na odpowiednie ustawienie fazy "pasującej". Ustaw ostrość obrazu za pomocą tylko pokrętła precyzyjnej regulacji, gdy soczewka obiektywu styka się z olejem.
   2. Zbadaj kilka pól widzenia, aby dostrzec zauważalne i spójne różnice między zmutowanymi szczepami a typem dzikim, takie jak zdolność do tworzenia zarodników, rozmiar i kształt zarodników oraz ogólna liczba zarodników (patrz Rysunek 1).
      NUTA: Alternatywą dla mikroskopii z kontrastem fazowym jest mikroskopia z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC) i proste techniki barwienia do stosowania w mikroskopach jasnego pola, takie jak barwienie fioletem krystalicznym.

Results

Rycina 1: Mikrofotografie z kontrastem fazowym przedstawiające reprezentatywne włókno powietrzne dla białych zmutowanych szczepów Streptomyces coelicolor zawierających losowe mutacje insercji transpozonów.

Materials