Ustanowienie binarnej kultury sacharybakterii z bakteriami gospodarza

Streszczenie

Źródło: Collins, A. J., et al., Ustanawianie stabilnych kultur binarnych symbiotycznych sacharybakterii z jamy ustnej. J . Vis. Exp. (2021)

Ten film demonstruje ustanowienie i utrzymanie binarnej kultury bakterii Saccharibacteria i bakterii gospodarza poprzez sekwencyjną współinkubację ich w pożywce wzrostowej specyficznej dla gospodarza.

Protokół

1. Koncentrat komórek sacharybakterii przez odwirowanie
   1. Zrób znak orientacyjny na probówce i nasadce, a następnie umieść probówkę w wirówce wysokoobrotowej ze znakiem na górnej stronie. Osad powstały w wyniku odwirowania jest zwykle niewidoczny. Oznakowanie pomoże określić, gdzie znajduje się osad komórek sacharybakterii po zakończeniu wirowania i wyjęciu probówki z wirówki.
   2. Odwirować próbki przy 60 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
      NUTA: Ta siła i czas są wystarczające do osadzenia wszystkich komórek sacharybakterii. Jednak komórki sacharybakterii można przynajmniej częściowo granulować przez wirowanie przez zaledwie 20 minut przy 20 000 x g.
   3. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki. Wylej płyn z tuby, trzymając granulki na górnej stronie tuby.
   4. Zawiesić zwykle niewidoczne osady w 1-2 ml buforu MRD (rozcieńczalnik do maksymalnego odzysku) poprzez energiczne wirowanie.

2. Infekuj kultury gospodarzy filtratem wzbogaconym w sacharybakterie

1. Przygotuj probówki hodowlane, umieszczając w probówkach 2 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej (np. TSBY (tryptyczny bulion sojowy z 0,1% ekstraktem drożdżowym), BHI (napar z mózgu i serca) itp.).
2. Do każdej probówki dodać 200 μl nocnej kultury organizmów gospodarza. Do każdej probówki dodać 100-200 μl przefiltrowanej próbki.
3. Inkubować połączone próbki, odpowiednie dla organizmu gospodarza (np. 37 °C, w atmosferze tlenowej dla Arachnia propionica).
4. Pasażuj komórki co dwa do trzech dni, przenosząc 200 μl kultury binarnej do 2 ml świeżej pożywki wzrostowej w nowej probówce. Jeśli okaże się, że pasażowane kultury nie wykazują wzrostu (tj. zmętnienie/gęstość optyczna kultury nie wzrasta po przejściu do świeżej pożywki), bakterie Saccharibacteria mogą przytłaczać lub zabijać wszystkie organizmy gospodarza. Aby temu zaradzić, dodaj 200 μl niezakażonej kultury gospodarza podczas pasażowania komórek. Powtórz dla co najmniej 5 fragmentów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rosół z naparu z serca mózgu (odwodniony proszek)	Becton-Dickinson powiedział:	211059	Lub inne podłoża wzrostowe odpowiednie dla organizmów docelowych
Wirnik wirówki 70-Ti	Beckman Coulter	337922
2 Schowek na rękawiczki Control InVitro	Nieśmiałe laoratoria	31615	W razie potrzeby w przypadku organizmów mikrotlenowych
Wirówka szybkoobrotowa Optima L-100 XP	Beckman Coulter	8043-30-1124
Mikropipeta P-1000	Gilson	F123601G
Mikropipeta P-200	Gilson	F123602G
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)	Fisher Naukowy	BP399500
Pepton	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP1420-500
Końcówki do pipet - 1000 μL	Fisher Naukowy	02-717-166
Końcówki do pipet - 200 μL	Fisher Naukowy	02-717-165
Stożkowe probówki wirówkowe z nakrętką 15 ml	Sokół	352096	Lub inna rurka odpowiednia do hodowli bakteryjnej
Grubościenne probówki wirówkowe z poliwęglanu 25 x 89 mm (pojemność 26,3 mL) z nakrętkami	Beckman Coulter	355618
Tryptyczne płytki agarowe z krwią sojową	Usługi laboratoryjne na północnym wschodzie	Zobacz materiał P1100	Lub inna płytka agarowa wystarczająca do wzrostu organizmów żywicielskich
Tryptyczny bulion sojowy (odwodniony proszek)	Becton-Dickinson powiedział:	211825	Lub inne podłoża wzrostowe odpowiednie dla organizmów docelowych
Ekstrakt drożdżowy	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP1422-500