Separacja nukleotydów (p)ppGpp izolowanych od bakterii wywołanych stresem za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Abstract

Źródło: Fernández-Coll, L. i Cashel, M. Stosowanie znakowania radiologicznego za pomocą mikromiareczkowania do wielokrotnych pomiarów in vivo Escherichia coli (p) ppGpp, a następnie chromatografii cienkowarstwowej. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film przedstawia wysokoprzepustowy protokół pomiaru poziomów i dynamiki bakteryjnych nukleotydów stresu-odpowiedzi ppGpp i pppGpp przy użyciu chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Metoda ta zapewnia wydajne, szybkie i ekonomiczne podejście do ilościowego oznaczania (p)ppGpp w kulturach bakteryjnych w różnych warunkach stresowych, umożliwiając analizę fizjologii bakterii w wysokiej rozdzielczości i rygorystyczną reakcję.

Protocol

1. Chromatografia cienkowarstwowa
   1. Miękkim ołówkiem zaznacz linię początkową w odległości 1 cm od krawędzi płytki do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) z polietyleneniminy-celulozy (PEI-celulozy) o wymiarach 20 cm x 20 cm, z której nożyczkami usunięto 5 cm od góry. Nanieść 5 μl w postaci kropli na powierzchnię PEI dla każdej próbki. Rozpocznij rosnący rozwój, nie dopuszczając do wyschnięcia tego miejsca, co poprawia rozdzielczość, minimalizując smugi.
   2. Wykonać rozwój rosnący w zbiorniku z warstwą 1,5 M roztworu KH₂PO₄ (pH 3,4) na tyle płytko, aby ciecz nie dotykała miejsca początkowego próbki. Przykr....

Results

Rysunek 1: Reprezentatywna analiza TLC. Schematyczne przedstawienie wyników uzyskanych po autoradiografii i badaniu przesiewowym luminoforowym w nocy z TLC. Miejsca, które mają być mierzone, są pokazane na czerwono. Pokazany jest ró.......

Materials