Separacja nukleotydów (p)ppGpp izolowanych od bakterii wywołanych stresem za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Abstract

Źródło: Fernández-Coll, L. i Cashel, M. Stosowanie znakowania radiologicznego za pomocą mikromiareczkowania do wielokrotnych pomiarów in vivo Escherichia coli (p) ppGpp, a następnie chromatografii cienkowarstwowej. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film przedstawia wysokoprzepustowy protokół pomiaru poziomów i dynamiki bakteryjnych nukleotydów stresu-odpowiedzi ppGpp i pppGpp przy użyciu chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Metoda ta zapewnia wydajne, szybkie i ekonomiczne podejście do ilościowego oznaczania (p)ppGpp w kulturach bakteryjnych w różnych warunkach stresowych, umożliwiając analizę fizjologii bakterii w wysokiej rozdzielczości i rygorystyczną reakcję.

Protocol

1. Chromatografia cienkowarstwowa
   1. Miękkim ołówkiem zaznacz linię początkową w odległości 1 cm od krawędzi płytki do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) z polietyleneniminy-celulozy (PEI-celulozy) o wymiarach 20 cm x 20 cm, z której nożyczkami usunięto 5 cm od góry. Nanieść 5 μl w postaci kropli na powierzchnię PEI dla każdej próbki. Rozpocznij rosnący rozwój, nie dopuszczając do wyschnięcia tego miejsca, co poprawia rozdzielczość, minimalizując smugi.
   2. Wykonać rozwój rosnący w zbiorniku z warstwą 1,5 M roztworu KH₂PO₄ (pH 3,4) na tyle płytko, aby ciecz nie dotykała miejsca początkowego próbki. Przykryj zbiornik hermetyczną uszczelką i pozwól, aby płyn dostał się na górę przyciętego arkusza, 15 cm. Aby osiągnąć pH 3,4 dla 1,5 M roztworu KH₂PO₄ , konieczne jest dostosowanie pH poprzez dodanie_H3PO₄.
   3. Usunąć całkowicie rozwinięty chromatogram i wysuszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej.
   4. Odciąć i wyrzucić górną część chromatogramu zawierającą wolne ³²P i wyrzucić do odpadów promieniotwórczych. Ta część jest przedstawiona w kolorze żółtym na rysunku 1 i jest łatwa do wizualizacji w świetle UV. W przypadku pomiaru tylko nukleotydów (p)ppGpp, które migrują wolniej niż trifosforan guanozyny (GTP), zaleca się uruchomienie wzorca GTP widocznego w promieniowaniu UV, a następnie wycięcie i wyrzucenie większej górnej części (wszystko powyżej GTP, jak pokazano na rysunku 1).
   5. Naświetlić filmy autoradiograficzne przez noc za pomocą ekranu luminoforowego.
   6. Wywołaj film. Uchwyć i określ ilościowo sygnał ekranu luminoforowego za pomocą luminofoimagera.
       
2. Kwantyfikacja (p)ppGpp
   1. Określ ilościowo plamy radioaktywne za pomocą obrazu J.
      NUTA: Ilość (p)ppGpp można znormalizować do całkowitej ilości nukleotydów G obserwowanych w każdej próbce (ryc. 1). Jeżeli ilość tła jest jednorodna, można odjąć pojedynczy pusty fragment (ramka 4 z rysunku 1) w celu skorygowania tła. Suma G jest sumą wykrytych GTP + ppGpp + pppGpp. Ta normalizacja zakłada, że poziomy monofosforanu guanozyny (GMP) i difosforanu guanozyny (GDP) są znikome, co jest prawdą w przypadku Escherichia coli. Stosunek danego nukleotydu do całkowitego G stanowi ważny sposób korygowania zmian w zastosowanej objętości próbki.

Results

Rysunek 1: Reprezentatywna analiza TLC. Schematyczne przedstawienie wyników uzyskanych po autoradiografii i badaniu przesiewowym luminoforowym w nocy z TLC. Miejsca, które mają być mierzone, są pokazane na czerwono. Pokazany jest ró...

Materials