Jednokomórkowa hodowla bakterii w gigantycznych pęcherzykach

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Morita, M., et al. Hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz gigantycznych pęcherzyków. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film pokazuje metodę hodowli i obserwacji pojedynczych komórek bakteryjnych zamkniętych w gigantycznych pęcherzykach zakotwiczonych w podpartej dwuwarstwie lipidowej. System umożliwia stabilne, długoterminowe obrazowanie dynamiki wzrostu pojedynczych komórek w ograniczonym, fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku.

Protokół

1. Przygotowanie systemu obserwacji pęcherzyków olbrzymich (GV) (System Hodowli Komórek Bakteryjnych)

Przygotowanie małych pęcherzyków (SV) do budowy podpartej membrany dwuwarstwowej
1. Wlać 20 μl roztworu POPC (1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfocholiny) i 4 μl roztworu biotyny-PEG-DSPE (1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[biotynylo(glikol polietylenowy)-2000) do szklanej probówki.
2. Odparować rozpuszczalnik organiczny za pomocą przepływu powietrza, aby utworzyć film lipidowy i umieścić tę próbkę w eksykatorze na 1 godzinę w celu całkowitego odparowania rozpuszczalnika organicznego.
3. Dodać 200 μl 200 mM glukozy w 1x pożywce LB (bulion Luria-Bertani) (zewnętrzny wodny roztwór GV) do szklanej fiolki.
4. Owinąć otwierającą się część szklanej fiolki folią i poddać sonikacji w łaźni ultradźwiękowej (120 W) przez co najmniej 1 godzinę.
5. Przygotuj SV metodą ekstruzji przy użyciu mini-ekstrudera i membrany poliwęglanowej o wielkości porów 100 nm.
Przygotowanie ręcznie robionej komory
1. Wywierć otwór o średnicy 7 mm za pomocą wydrążonego stempla na dwustronnej uszczelce (10 mm x 10 mm x 1 mm).
2. Wklej dwustronną uszczelkę z otworem w szkle nakrywkowym (30 mm x 40 mm, grubość 0,25–0,35 mm).
Przygotowanie podpartej dwuwarstwowej membrany na szkle nakrywkowym w otworze studzienki
1. Dodać 30 μl roztworu SV do otworu komory (przygotowanego w ppkt 2.2) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
2. Delikatnie przemyć otwór dwukrotnie 20 μl pożywki 1x LB zawierającej 200 mM glukozy (zewnętrzny wodny roztwór GV) przez pipetowanie.
Unieruchomienie GV na podpartej membranie dwuwarstwowej na szkle nakrywkowym w otworze komory
1. Wprowadzić 10 μl neutrawarydyny z zewnętrznym wodnym roztworem GV (1 mg/ml) do otworu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
2. Delikatnie przemyć otwór dwukrotnie 20 μl pożywki 1x LB zawierającej 200 mM glukozy (zewnętrzny wodny roztwór GV) przez pipetowanie.
3. Dodać cały roztwór zawierający GV do otworu komory i zamknąć szkłem nakrywkowym (18 mm x 18 mm, grubość 0,13–0,17 mm) (Rysunek 1b).
Obserwacja mikroskopowa wzrostu komórek bakteryjnych wewnątrz GV
1. Ustaw mikroskopijny system ogrzewania z odwróconym mikroskopem wyposażonym w soczewkę obiektywową o aperturze numerycznej (NA) 40x/0,6 o dużej odległości roboczej (Rysunek 1b).
2. Umieść komorę na mikroskopijnym systemie ogrzewania stage (Rysunek 1b). Inkubować GV zawierające komórki bakteryjne w komorze w warunkach statycznych przez 6 godzin w temperaturze 37 °C.
3. Rejestruj i rejestruj obrazy mikroskopowe wzrostu komórek bakteryjnych wewnątrz GV co 30 minut za pomocą naukowej kamery z komplementarnym półprzewodnikiem tlenku metalu (sCMOS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ryc. 1: System obserwacji hodowli komórek bakteryjnych wewnątrz GV. a) GV są unieruchomione na podpartej membranie poprzez wiązanie biotyny i neutrawidyny na szkle nakrywkowym. GV są inkubowane przez system grzewczy.