Badanie reakcji bakterii na etylen przy użyciu związku uwalniającego etylen

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Augimeri, R. V. i wsp., Wykorzystanie związku uwalniającego etylen, kwasu 2-chloroetylofosfonowego, jako narzędzia do badania odpowiedzi etylenu u bakterii. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje wpływ etylenu wytwarzanego przez kwas 2-chloroetylofosfonowy () na wzrost bakterii i produkcję celulozy. Etylen aktywuje szlaki sygnałowe, które stymulują syntezę celulozy, co skutkuje zwiększonym tworzeniem błonki. Wyniki te podkreślają reakcję bakterii na etylen.

Protokół

Testy błonki
1. Hoduj i oznaczaj ilościowo kultury starterowe Komagataeibacter xylinus w trzech egzemplarzach:
  1. W trzech powtórzeniach zaszczepić pojedynczą kolonię Komagataeibacter xylinus w 5 ml pożywki Schramm and Hestrin (SH) (pH 5) uzupełnionej 0,2% (v/v) celulazy sterylizowanej filtrem. Inkubować kultury w temperaturze 30 °C z mieszaniem przy 150 obr./min, aż do osiągnięcia gęstości optycznej przy 600 nm (OD₆₀₀) wynoszącej 0,3-0,4 (około 72 godzin).
  2. Zebrać kultury starterowe przez odwirowanie (2 000 x g; 4 °C; 10 min). Umyć komórki dwukrotnie 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej i ponownie zawiesić osad komórek. Utrzymuj komórki na lodzie.
  3. Określ ilościowo komórki za pomocą komory liczącej Petroffa-Haussera.
2. Przygotować mieszanki wzorcowe do zaszczepienia płytek 24-dołkowych:
  1. Uzupełnić 60 ml pożywki SH (pH 7) 120 μl 5, 50 i 500 mM kwasu 2-chloroetylofosfonowego () w celu uzyskania końcowych stężeń wynoszących odpowiednio 0,01, 0,1 i 1,0 mM. Uzupełnić kolejne 60 ml pożywki SH (pH 7) 120 μl rozpuszczalnika użytego do rozpuszczenia. Wirować do mieszania.
  2. Podzielić każde 60 ml pożywki zawierającej na cztery podwielokrotności po 14 ml. Zaszczepić trzy z 14 ml podwielokrotności biologicznymi powtórzeniami kultury starterowej w stężeniu 10,5 komórek/ml. Trzymaj probówki z komórkami na lodzie, aby zapobiec produkcji celulozy.
    NUTA: Pozostała 14 ml podwielokrotności zostanie wykorzystana do sterylnych studzienek kontrolnych.
3. Zaszczepić płytki 24-dołkowe:
  1. Badać każdy zabieg na osobnej płytce z trzema rzędami powtórzeń biologicznych i rzędem sterylnych kontroli (ryc. 1).
  2. Używając 14 ml mieszanki wzorcowej, dodać 2 ml do każdego z sześciu dołków sterylnej płytki 24-dołkowej. Komplet dla trzech kontrprób biologicznych i sterylnej kontroli (ryc. 1). Powtórz tę czynność dla każdego zabiegu.
  3. Uszczelnić płytki folią parafinową i inkubować statycznie przez 7 dni w temperaturze 30 °C.
  4. Zbierz i zmierz suchą masę błonki (uzysk celulozy) (rysunek 1):
    1. Indywidualnie przenieś błonki do dołków 6-dołkowej płytki. Aby poddać komórki lizie, należy potraktować błonki 12 ml 0,1 N wodorotlenku sodu (NaOH) w temperaturze 80 °C przez 20 minut.
    2. Usuń NaOH i zneutralizuj błonki, przemywając ultra czystą wodą przez 24 godziny z mieszaniem. Zmieniaj wodę co 6 godzin.
      NUTA: Błonki powinny być białe po zakończeniu etapu mycia.
    3. Umieścić obciążniki błonki na matach silikonowych i suszyć w temperaturze 50 °C przez 48 godzin do stałej masy. Po wyschnięciu wyjmij je z mat i zmierz ich wagę na wadze analitycznej, aby określić wydajność celulozy bakteryjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat blokowy ilustrujący protokół stosowany do oznaczania i analizy błonki. Podstawowa pożywka o pH 7 SH (60 ml) uzupełniona jest podawana dla trzech oddzielnych inokulacji replik biologicznych i sterylnej kontroli (po 14 ml każda). Kultury te są następnie r...