Ten film pokazuje zależną od inicjatora amplifikację plazmidu samobójczego u E. coli. Plazmid, który jest nosicielem genu oporności na antybiotyki, replikuje się tylko w obecności białka inicjującego kodowanego przez gospodarza. Po elektroporacji i inkubacji w pożywce regeneracyjnej, mieszaninę umieszcza się na agarze zawierającym antybiotyk. Bakterie z plazmidem przeżywają, ponieważ ich białko inicjujące umożliwia ekspresję genu oporności plazmidu na antybiotyki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Amplifikacja plazmidu samobójczego w gospodarzu bakteryjnym
813 wyświetleń
⸱
26 września 2025
W tym artykule
Streszczenie
Protokół
1. Generowanie mutantów zerowych w genach wyspy glikozylacji wici
UWAGA: Ta metoda mutagenezy opiera się na allelicznej wymianie produktów delecji w ramce reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przy użyciu wektora samobójczego pDM428 (GenBank: KC795686.1). Replikacja wektora pDM4 jest zależna od lambda pir , a pełna wymiana alleliczna jest wymuszona przez wykorzystanie genu sacB znajdującego się na wektorze.
- Budowa produktów do usuwania w ramce PCR.
- Zaprojektuj dwie pary starterów, które amplifikują regiony DNA przed (startery A i B) i za (startery C i D) wybranego genu lub regionu, któr....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 1: Bioinformatyczna detekcja regionów chromosomowych i projekt startera. (A) Schemat regionów chromosomalnych zidentyfikowanych u A. hydrophila AH-1 i A. piscicola AH-3. Wyspa glikozylacji wici A. hydrophila AH-1 jest reprezentatywna .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Zestaw reakcyjny gotowy do sekwencjonowania cyklu | Biosystemy stosowane | 4337455 | Służy do sekwencjonowania |
| Polimeraza DNA AccuPrime Taq, wysoka wierność | Invitrogen | 12346-086 | Służy do amplifikacji fragmentów AB, CD i AD |
| Agarozy | Conda-Pronadise | 8008 | Służy do elektroforezy DNA |
| Fosfataza alkaliczna jelitowa cielęcia () | Preparat Promega | Zobacz materiał M1821 | Służy do usuwania fosforanów na końcu 5' |
| Agar baktonowy | Becton Dickinson | 214010 | Służy do analizy ruchliwości |
| BamHI powiedział: | Preparat Promega | Czynnik R6021 | Stosowany do ograniczenia endonukleazy |
| BglII (Silnik BglII) | Preparat Promega | Czynnik R6081 | Stosowany do ograniczenia endonukleazy |
| BioDoc-It Imagin System | Promieniowanie UVP | Stanowisko bioobrazowania służące do wizualizacji DNA | |
| Polimeraza Biotaq | Bioline (Bioline) | BIO-21040 powiedział: | Służy do badań przesiewowych kolonii |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA i zestaw do oczyszczania opaski żelowej | Cytiwia | 28-9034-71 | Służy do oczyszczania amplikonów PCR i fragmentów DNA. |
| EDTA | Aplikacja | 131026.1211 | Służy do elektroforezy DNA |
| Kuwety do elektroporacji 2 mm szczelina | Firma VWR | 732-1133 | Używany do transformacji |
| Luria-Bertani (LB) Agar Miller | Condalab (Biblioteka Kondala) | 996 | Używany do hodowli Escherichia coli |
| Rosół Luria-Bertani (LB) Miller | Condalab (Biblioteka Kondala) | 1551 | Używany do hodowli Escherichia coli |
| Nanokropla ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spektrofotometr używany do ilościowego oznaczania DNA | |
| Ryfampicyna | Aplikacja | A2220,0005 | Służy do krycia trójrodzicielskiego |
| SOC Średni | Invitrogen | 15544034 | Służy do odzysku elektroporacji |
| Ligaza DNA T4 | Invitrogen | 15224017 | Służy do reakcji podwiązania |
| Veriti 96-studniowy termocykler | Biosystemy stosowane | Używany w reakcjach PCR |
