Izolacja bakterii Gram-ujemnych z insercją transpozonów genomowych

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Kazi, M. I., et al., Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. J . Vis. Exp. (2020)

Ten film pokazuje selekcję, kwantyfikację i zachowanie bakterii biorców Gram-ujemnych przenoszących inserpozycje transpozonów w oparciu o oporność na kanamycynę.

Protokół

Generowanie końcowej biblioteki mutantów bakteryjnych

Rozmrozić podwielokrotność zamrożonego krycia na lodzie.
Łączenie płytek na płytkach agarowych Luria-Bertani (LB) o średnicy 150 mm uzupełnionych kanamycyną na podstawie jednostek tworzących kolonie (CFU) obliczonych w kroku 3.1. Dostosuj objętość za pomocą LB, aby uzyskać 13 333 kolonii na 150 μl przed posiewem.
NUTA: Liczba CFU została tutaj określona na około 10⁵ CFU/ml, więc objętość krycia dostosowano tak, aby uzyskać 13 333 kolonii na płytkę. Zapewniłoby to optymalną liczbę kolonii na 30 płytkach dla biblioteki mutantów o wysokiej rozdzielczości bez przepełniania płytek.
Za pomocą sterylnych szklanych kulek rozprowadzić 150 μl rozcieńczenia na płytce na płytkach agarowych Luria-Bertani o wymiarach 30 x 150 mm uzupełnionych kanamycyną, aby uzyskać 400 000 kolonii (ryc. 1C).
NUTA: Sterylne pręty lub wszelkiego rodzaju sterylne narzędzia do rozsiewania (np. szklane koraliki) mogą być używane do rozprowadzania bakterii na płytkach.
Wyrzuć zużytą rurkę zawierającą nadmiar krycia.
NUTA: Cykle zamrażania/rozmrażania powodują selektywne naciski na kulturę bakteryjną, co może zniekształcić wyniki eksperymentu Tn-seq. Za każdym razem należy używać nowej porcji.
Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 14 godzin.
NUTA: Czas inkubacji jest zoptymalizowany, aby zapobiec przerostowi (stykaniu się kolonii). Sugeruje się minimalizację wzrostu poprzez skrócenie czasu inkubacji.

Szacowanie zagęszczenia biblioteki i pulowania dla magazynu

Policz jtk na każdej płytce, aby oszacować całkowitą liczbę mutantów w bibliotece transpozonów. Policz 20% z co najmniej 3 płytek, aby określić szacunkową liczbę kolonii dla całej grupy płytek (ryc. 2A). Upewnij się, że kolonie nie stykają się z inną kolonią.
Po obliczeniu szacowanej wydajności kolonii dodaj 3-5 ml LB (lub więcej w razie potrzeby) do każdej płytki i zeskrob bakterie za pomocą sterylnego narzędzia do skrobania. NUTA: Sterylne pętle zaszczepiające służyły do skutecznego skrobania płytek.
Zawiesiny bakteryjne ze wszystkich płytek należy zebrać w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml (ryc. 1D). Będzie to wymagało wielu stożkowych probówek o pojemności 50 ml, co najmniej 3.
Zawiesina bakteryjna w postaci granulatu przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 7 min.
Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml LB uzupełnionego 30% glicerolem.
Podwielokrotność 1 ml z biblioteki transpozonów do kriowialiów i przechowywać w temperaturze -80 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat budowy biblioteki mutantów transpozonów. (A) Koniugacja bakteryjna. Szczep "dawcy", który koduje maszynerię transpozycyjną, został zmieszany ze szczepem "biorcy". Mieszaninę nakrapiano na płytkach agarowych Luria-Bertani (LB)...