$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Naturalna przemiana
NUTA: Jako odbiorcę użyto pochodnej N315, N2-2.1. W tym szczepie locus sigH został zduplikowany, aby konstytutywnie wyrazić SigH. Jeśli marker rezystancji, który ma być przeniesiony, nie jest chloramfenikolem, do wyrażenia SigH można użyć pRIT-sigH (CmR). Oczyszczony plazmid lub ekstrakt całego DNA z S. aureus COL-45 pozyskanego przez cfr jest używany jako DNA dawcy do transformacji.
- Przygotowanie DNA dawcy
- Uprawiać COL-45 przez noc z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C w kolbie o pojemności 300 ml zawierającej 50 ml bulionu sojowego tryptycznego (TSB) uzupełnionego 32 mg/l chloramfenikolu. Kultura E. coli HST04 przenosząca plazmid pHY300 (TetR) w celu ekstrakcji plazmidu do eksperymentu kontrolnego.
NUTA: HST04 (dam-/dcm-) nie ma genów metylazy DNA. Inne konwencjonalne szczepy z metylazą DNA mogą być również używane do przygotowania dawcy DNA, ponieważ stan metylacji DNA nie wpływa na wydajność transformacji. Alternatywnie, plazmid pT181 oczyszczony ze szczepu S. aureus COL może być również stosowany jako kontrola pozytywna do testu transformacji. - Zebrać komórki przez odwirowanie (8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C).
- Wyodrębnij plazmidy za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidowego DNA lub konwencjonalnej metody oczyszczania DNA w celu oczyszczenia całego DNA.
- Oznaczyć ilościowo oczyszczone DNA za pomocą spektrometru i utrzymywać je w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
NUTA: Do testu transformacji należy użyć świeżego preparatu DNA, zwykle młodszego niż tydzień. Stare preparaty DNA obniżają efektywność przemiany.
- Test transformacyjny
- Hodować komórkę biorczą (N2-2,1) przez noc w 5 ml TSB w temperaturze 37 °C, wstrząsając.
- Przenieść 0,5 ml kultury na noc do probówki o pojemności 1,5 ml. Wytrącić komórki przez odwirowanie (10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C).
- Zawiesić komórki z 10 ml pożywki CS2 w probówce o pojemności 50 ml.
NUTA: Pożywka CS2 jest kompletnym syntetycznym podłożem, które indukuje kompetencję do naturalnej przemiany u S. aureus. Inne standardowe pożywki laboratoryjne, takie jak TSB lub infuzja serca mózgu (BHI), nie nadają się do transformacji. - Hodować bakterie w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (180 obr./min) aż do późnej fazy wykładniczej (około 8 godzin).
- Zebrać komórki przez odwirowanie (5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C).
- Zawiesić komórki w 10 ml świeżej pożywki CS2.
- Dodać 10 μg oczyszczonego plazmidu lub genomu DNA (krok 1.1.4) do zawiesiny komórki. Wstrząsać w temperaturze 37 °C i 180 obr./min przez 2,5 godziny.
NUTA: Krótszy czas inkubacji z DNA (<2,5 godziny) skutkuje niższymi częstotliwościami przemian. - Zebrać komórki przez odwirowanie (5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C).
- Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki BHI. Zmieszać zawiesinę komórkową z 90 ml stopionego agaru BHI (55 °C) z dodatkiem 32 mg/l chloramfenikolu (lub 5 mg/l tetracykliny w doświadczeniu kontrolnym). Wlej mieszaninę na szalki Petriego o średnicy 90 mm. Szybko ostudź i pozwól agarowi stężeć.
- Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 2 dni.
- Replikacja wygenerowanych kolonii (transformantów) poprzez przeniesienie kolonii (za pomocą wykałaczek) na nowe płytki agarowe BHI zawierające odpowiednie antybiotyki w celu potwierdzenia ich charakterystyki oporności. Potwierdź nabyty gen oporności (cfr lub tetM) za pomocą PCR kolonii.