Ocena śmiertelności larw C. elegans wywołanej przez bakterie chorobotwórcze

Streszczenie

Źródło: Anderson, Q. L., et al. Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)

Film przedstawia test na bazie cieczy, w którym genetycznie zmodyfikowane larwy C. elegans są narażone na działanie bakterii chorobotwórczych na mikropłytce. Toksyny bakteryjne wydzielane do pożywki wywołują stres i śmierć gospodarza. Barwnik fluorescencyjny barwi martwe robaki, umożliwiając ilościowe określenie śmiertelności na podstawie obrazowania w celu oceny podatności genetycznej lub odporności.

Protokół

1. Konfiguracja testu zabijania płynów (protokół podstawowy)

Nuta: Jest to protokół dla jednego szczepu bakteryjnego i jednego źródła robaków.

1. Za pomocą skrobaka do komórek usunąć Pseudomonas aeruginosa z płytki Slow Killing lub SK i ponownie zawiesić w ~ 5 ml S Basal. W razie potrzeby zwiększ skalę. Zmierzyć gęstość optyczną zawiesiny bakteryjnej za pomocą spektrofotometru (OD₆₀₀)
2. Przygotować 24 ml rozcieńczonego bulionu P. aeruginosa w S Basal przy OD₆₀₀ ≈ 0,09 (3X stężenie końcowe). Patrz 4.6.2 dla końcowej zawartości na studzienkę i odpowiednio zwiększyć objętość rozcieńczenia bakteryjnego.
3. Dodać 21 ml płynnej pożywki Slow Kill (3 g NaCl, 3,5 g peptonu/L uzupełnione CaCl₂ i_MgSO4 do końcowego stężenia 1 mM). Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 45 μl bakterii i pożywki do każdego dołka płytki 384-dołkowej.
4. Umyj robaki z ich źródła do stożkowej rurki o pojemności 50 ml i pozwól robakom osiąść pod wpływem siły grawitacji. Odessać supernatant do 5 ml. Zawiesić w sumie 50 ml S base.
5. Powtórz krok 1.4 dwa razy.
6. Za pomocą sortera robaków posortuj około 22 robaki do każdego dołka płytki 384-dołkowej.
   Nuta: Zestaw wrzuca każdego robaka do ~1,1 μl płynu. 22 robaki będą miały 25 μl, co zwiększy całkowitą objętość testu do 70 μl/studzienkę.
   1. Ostateczny skład każdej studzienki składa się z 70 μL. 45 μL tej objętości dodaje się jako pożywkę bakteryjną (0,03 OD₆₀₀ bakterii w 24 μl S Basal i 21 μL SK uzupełnione CaCl₂ i MgSO₄). Pozostałe 25 μl dodaje się wraz z 22 robakami.
   2. Jeśli używany tutaj sorter (patrz Tabela materiałów) jest niedostępny, robaki można rozcieńczyć do końcowego stężenia 1 robaka/μl w S Basal i odpipetować 25 μl/studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej. Jednak wyniki mogą wykazywać zwiększoną zmienność. Alternatywnie możliwe jest użycie dozownika płynu perystaltycznego, zgodnie z opisem Leunga i współpracowników.
7. Po posortowaniu robaków na płytkę 384-dołkową, należy uszczelnić płytkę folią przepuszczającą gaz i inkubować płytki w temperaturze 25 °C przez 24-48 godzin.
8. W żądanym czasie za pomocą myjki do mikropłytek umyć płytkę 384-dołkową preparatem S Basal w sumie 5 razy.
   1. Po drugim płukaniu odessać większość pożywki, pozostawiając ~20 μL. Energicznie potrząsaj płytkami za pomocą wirownika do mikropłytek przez co najmniej 30 sekund, aby poluzować wszelkie zanieczyszczenia z dna studzienek).
9. Po ostatnim płukaniu odessać supernatant do 20 μL. Dodać 50 μl 0,98 μM barwienia kwasem nukleinowym (patrz tabela materiałów)/studzienkę płytki 384-dołkowej, aby uzyskać końcowe stężenie 0,7 μM.
10. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 12 - 16 godzin. Ten barwnik poplami tylko martwe robaki. Po pożądanym okresie inkubacji umyj płytki za pomocą myjki do mikropłytek, aby usunąć nadmiar plam (minimum 3 prania).
11. Do zbierania danych należy użyć spektrofotometru lub mikroskopu automatycznego, aby zobrazować zarówno światło przechodzące, jak i fluorescencję (wzbudzenie 531 nm i emisja 593 nm).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
COPAS FP BioSorter	Unijna Biometria		Cytometr przepływowy dużych obiektów/sortownik ślimakowy
Cytat 5	BioTek
EL406 Dozownik do spryskiwaczy	BioTek
Multitron Pro	Infors HT
24 Blok RB studni głębinowej	Thermo Fisher Naukowy	CS15124
Płytka 384-dołkowa	Greiner Bio-One	Zobacz materiał MPG-781091
Pożywki do hodowli nicieni (NGM)			Ilość na litr: 18 gramów agaru, 3 gramy NaCl, 2,5 grama peptonu, 1 ml CaCl₂ (1 M), 1 ml MgSO₄ (1 M), 25 ml buforu fosforanowego i 973 ml wody mili-Q
Tabliczki powolnego zabijania (SK)			Ilość na litr: 18 gramów agaru, 3 gramy NaCl, 3,5 grama peptonu, 1 ml CaCl₂ (1 M), 1 ml MgSO₄ (1 M), 25 ml buforu fosforanowego i 973 ml wody mili-Q
Nośniki do powolnego zabijania (SK)			Ilość na litr: 3 gramy NaCl, 3,5 grama peptonu, 1 ml CaCl₂ (1 M), 1 ml MgSO₄ (1 M), 25 ml buforu fosforanowego i 973 ml wody mili-Q
Rosół lizogeniczny (LB)	USBiologiczne nauki przyrodnicze	L1520
Rosół z naparu Briana Heart (BHI)	Produkty badawcze International Corp	50-488-526
Roztwór wybielacza robaków			Ilość na 100 ml: 10 ml 5 M roztworu NaOH, 20 ml 5% roztworu podchlorynu sodu i 70 ml sterylnej wody
S Podstawowy			Ilość na litr: 5,85 grama NaCl, 6 gramów KH₂PO₄, 1 gram K₂HPO₄ i 1 litr wody mili-Q
Agar	USBiologiczne nauki przyrodnicze	Nr kat. A0930
Zawartość NaCl	USBiologiczne nauki przyrodnicze	Zobacz materiał S5000
Pepton	USBiologiczne nauki przyrodnicze	Zobacz materiał P3300
CaCl₂ powiedział:	USBiologiczne nauki przyrodnicze
MgSO₄	Fisher Naukowy	Zobacz materiał M63-500
Bufor fosforanowy			ilość na litr: 132 ml K₂HPO₄ (1M) i 868 ml KH₂PO₄ (1M)
KH₂PO₄ powiedział:	Acros Organics	7778-77-0
K₂HPO₄ powiedział:	USBiologiczne nauki przyrodnicze	Zobacz materiał P5100
5% roztwór podchlorynu sodu	BICCA (Biblioteka Biblijna)	7495.5-32
Roztwór NaOH	Fisher Naukowy	Zobacz materiał SS255-1
Oddychaj spokojnie	Zdywersyfikowana biotechnologia	Zobacz materiał BEM-1
SYTOX Pomarańczowa plama kwasu nukleinowego	Fisher Naukowy	Zobacz materiał S11368
Szczepy bakteryjne
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis (OG1RF)
Pożywienie E. coli (OP50)
Bakteria E. coli Bakterie wykazujące ekspresję RNAi (HT115)
Szczepy robaków
glp-4(bn2) (Beanan i Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::Reporter GFP (Kang i in., 2018, PMID: 29532717)