Ocena śmiertelności larw C. elegans wywołanej przez bakterie chorobotwórcze

Streszczenie

Źródło: Anderson, Q. L., et al. Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)

Film przedstawia test na bazie cieczy, w którym genetycznie zmodyfikowane larwy C. elegans są narażone na działanie bakterii chorobotwórczych na mikropłytce. Toksyny bakteryjne wydzielane do pożywki wywołują stres i śmierć gospodarza. Barwnik fluorescencyjny barwi martwe robaki, umożliwiając ilościowe określenie śmiertelności na podstawie obrazowania w celu oceny podatności genetycznej lub odporności.

Protokół

1. Konfiguracja testu zabijania płynów (protokół podstawowy)

Nuta: Jest to protokół dla jednego szczepu bakteryjnego i jednego źródła robaków.

1. Za pomocą skrobaka do komórek usunąć Pseudomonas aeruginosa z płytki Slow Killing lub SK i ponownie zawiesić w ~ 5 ml S Basal. W razie potrzeby zwiększ skalę. Zmierzyć gęstość optyczną zawiesiny bakteryjnej za pomocą spektrofotometru (OD₆₀₀)
2. Przygotować 24 ml rozcieńczonego bulionu P. aeruginosa w S Basal przy OD₆₀₀ ≈ 0,09 (3X stężenie końcowe). Patrz 4.6.2 dla końcowej zawartości na studzienkę i odpowiednio zwiększyć objętość rozcieńczenia bakteryjnego.
3. Dodać 21 ml płynnej pożywki Slow Kill (3 g NaCl, 3,5 g peptonu/L uzupełnione CaCl₂ i_MgSO4 do końcowego stężenia 1 mM). Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 45 μl bakterii i pożywki do każdego dołka płytki 384-dołkowej.
4. Umyj robaki z ich źródła do stożkowej rurki o pojemności 50 ml i pozwól robakom osiąść pod wpływem siły grawitacji. Odessać supernatant do 5 ml. Zawiesić w sumie 50 ml S base.
5. Powtórz krok 1.4 dwa razy.
6. Za pomocą sortera robaków posortuj około 22 robaki do każdego dołka płytki 384-dołkowej.
   Nuta: Zestaw wrzuca każdego robaka do ~1,1 μl płynu. 22 robaki będą miały 25 μl, co zwiększy całkowitą objętość testu do 70 μl/studzienkę.
   1. Ostateczny skład każdej studzienki składa się z 70 μL. 45 μL tej objętości dodaje się jako pożywkę bakteryjną (0,03 OD₆₀₀ bakterii w 24 μl S Basal i 21 μL SK uzupełnione CaCl₂ i MgSO₄). Pozostałe 25 μl dodaje się wraz z 22 robakami.
   2. Jeśli używany tutaj sorter (patrz Tabela materiałów) jest niedostępny, robaki można rozcieńczyć do końcowego stężenia 1 robaka/μl w S Basal i odpipetować 25 μl/studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej. Jednak wyniki mogą wykazywać zwiększoną zmienność. Alternatywnie możliwe jest użycie dozownika płynu perystaltycznego, zgodnie z opisem Leunga i współpracowników.
7. Po posortowaniu robaków na płytkę 384-dołkową, należy uszczelnić płytkę folią przepuszczającą gaz i inkubować płytki w temperaturze 25 °C przez 24-48 godzin.
8. W żądanym czasie za pomocą myjki do mikropłytek umyć płytkę 384-dołkową preparatem S Basal w sumie 5 razy.
   1. Po drugim płukaniu odessać większość pożywki, pozostawiając ~20 μL. Energicznie potrząsaj płytkami za pomocą wirownika do mikropłytek przez co najmniej 30 sekund, aby poluzować wszelkie zanieczyszczenia z dna studzienek).
9. Po ostatnim płukaniu odessać supernatant do 20 μL. Dodać 50 μl 0,98 μM barwienia kwasem nukleinowym (patrz tabela materiałów)/studzienkę płytki 384-dołkowej, aby uzyskać końcowe stężenie 0,7 μM.
10. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 12 - 16 godzin. Ten barwnik poplami tylko martwe robaki. Po pożądanym okresie inkubacji umyj płytki za pomocą myjki do mikropłytek, aby usunąć nadmiar plam (minimum 3 prania).
11. Do zbierania danych należy użyć spektrofotometru lub mikroskopu automatycznego, aby zobrazować zarówno światło przechodzące, jak i fluorescencję (wzbudzenie 531 nm i emisja 593 nm).

Materiały